近年来,CRISPR/Cas9技术快速发展,其作为靶向基因组修饰的有效工具,引入特定的DNA双链断裂(DSB),再通过内源DNA修复机制完成修复。CRISPR/Cas9系统被广泛地运用于动物遗传工程,在动物基因组中产生敲除、插入和点突变。相比于传统的ZFN和TALEN基因编辑技术,其效率更高且序列选择的限制更少(基因组中只需要GG),它的构建程序简单方便,适用于大规模的动物基因编辑。绵羊是一种重要的经济动物,同时也是遗传病生物医学中不可或缺的大动物模型。在绵羊基因组中应用基因编辑技术可以促进品种改良,提高家畜育种水平,使动物表型快速向人们期望的方向变化。肌肉发育是家畜的重要经济特征之一,而肌肉生长抑制素(MSTN)基因被认为是与肌肉发育和瘦肉率相关的主要基因。在大多数研究中,通过设计sgRNA来靶向至目的基因,从而实现基因敲除。然而,较少的基因碱基突变对目的基因的功能影响可能很小,特别是对杂合子羊或嵌合体羊。因此,进一步研究大的基因片段敲除是有必要的。因此,本试验旨在利用CRISPR/Cas9系统来对绵羊的MSTN基因进行敲除以探究其作用效果。本研究以宁夏滩羊为对象,选择肌肉生长抑制素(MSTN)基因作为靶基因,把基因精准敲除、高效率敲除、大片段敲除作为研究目标,设计了3个MSTN基因的sgRNA,分别在绵羊胎儿成纤维细胞和活体羔羊上,验证了CRISPR/Cas9系统,且对胎儿成纤维细胞和基因编辑阳性羔羊潜在的脱靶位点进行脱靶检测,对比分析了MSTN基因敲除绵羊与野生型绵羊肌肉组织中MSTN的表达含量以及其对应的羔羊体重。获得的主要结果如下:(1)胎儿成纤维细胞上的效率验证。通过在MSTN基因的第一,第二,第三外显子设计sgRNA,同时转染成纤维细胞,获得CRISPR/Cas9系统靶向编辑的细胞,检测编辑效率发现3个sgRNA敲除效率均在40%-60%之间,表明设计的基因编辑系统能够高效打靶绵羊细胞的MSTN基因。而且,通过对预测的潜在脱靶位点进行检测,未发现任何脱靶突变。(2)基因敲除滩羊的制备。使用设计的sgRNA和Cas9构建体外表达载体,体外转录获得Cas9mRNA和sgRNA;在单细胞期时,同时于640枚胚胎中注射Cas9mRNA和sgRNAs混合液,经体外培养,将发育良好的585枚胚胎移植给120只受体母体,最终获得了35只活体羔羊。经检测发现其中10只羔羊存在靶向敲除,因此敲除效率为28.6%(10/35)。在编辑成功的10只编辑羊中,有3只(3/10,30%)产生了大片段基因缺失(~5 kb)。进一步预测并检测了脱靶序列,未发现脱靶效应。(3)基因敲除滩羊的表型分析。采取基因编辑羔羊臀部肌肉组织,通过蛋白质免疫印迹检测MSTN蛋白表达量,发现阳性羊的MSTN蛋白水平低于野生型中的表达量,表明MSTN基因敲除有效影响了MSTN基因在骨骼肌的蛋白表达。(4)观测基因编辑羔羊从0 d到180 d的体重变化(每30 d记录一次),发现基因敲除羔羊的初生重显著高于对照组(p<0.01),且基因编辑羔羊相比野生型日增重显著提高(180 g/d与142 g/d)。综上所述,本研究成功构建了MSTN基因敲除滩羊,并获得了MSTN大片段敲除的羔羊。通过CRISPR/Cas9系统成功在绵羊身上实现精确的大片段敲除,对其他大动物模型的利用和开发具有借鉴意义,为进一步实施聚合育种提供技术支撑,创制了育种材料。