灰飞虱(Laodelphax striatellus)是水稻上的重要害虫,它不仅可以刺吸水稻造成虫害,而且还可以传毒引发水稻病毒病,给农业造成巨大损失。同时,长期使用化学药剂防治使灰飞虱的抗药性日渐增强,因此需要研究和开发新的灰飞虱防治技术。RNA干扰(RNAi)不但可以用于研究基因的功能,还可以沉默靶标基因干扰生物的特定生命过程。因此通过深入研究,发掘高效专一性靶基因和RNAi技术,有可能开辟针对性的害虫RNAi防控新途径。海藻糖酶是昆虫糖代谢的重要调节酶,一般分为两种类型,分别是水溶性海藻糖酶(Soluble Trehalase)和膜结合型海藻糖酶(Membrane-bound Trehalase)。本文克隆了灰飞虱的海藻糖酶基因,并通过合成和喂食dsRNA进行基因干扰,研究取食海藻糖酶基因dsRNA对灰飞虱的毒理学效应。现将研究结果总结如下：1.通过灰飞虱转录组数据分析并结合RACE技术,克隆了灰飞虱两个海藻糖酶基因的全长cDNA,它们均具有海藻糖酶基因的典型特征,与已报道的其他昆虫的海藻糖酶基因具有很高的相似性,并表现出一定的虫种亲缘关系。其中水溶性海藻糖酶全长2042bp,开放阅读框编码602个氨基酸,包括N端25个氨基酸的信号肽,但无跨膜结构域,被命名为LSTre-1。膜结合型海藻糖酶全长2619bp,开放阅读框编码618个氨基酸,包括N端26个氨基酸的信号肽,同时有2个跨膜结构域,被命名为LSTre-2。灰飞虱海藻糖酶全长cDNA的克隆为进一步研究其RNAi效应等奠定了基础。2.合成dsRNA喂食灰飞虱2龄若虫,测定了干扰两种海藻糖酶基因对灰飞虱的致死效应。结果发现,喂食dsTre-1若虫死亡率(38.89%)是喂食dsGFP对照试虫(1.59%)的24.5倍,喂食dsTre-2若虫死亡率(27.72%)是喂食dsGFP对照试虫的17.4倍,表明干扰灰飞虱两种海藻糖基因均能引起显著的致死效应,其中,干扰水溶性海藻糖酶基因比干扰膜结合型的致死效果更高。3.为了进一步证明喂食两种海藻糖酶基因dsRNA对灰飞虱的致死效应确系海藻糖酶基因的RNAi所致,本研究就喂食dsRNA对海藻糖酶基因的mRNA表达水平和酶活水平进行了研究。结果表明,dsGFP处理对海藻糖酶基因的表达量没有显著影响,而喂食含dsTre-1饲料的试虫体内,LSTre-1的表达量下降了49.06%,LSTre-2的表达量下降了21.53%。但喂食含dsTre-2饲料的试虫,LSTre-1的表达量下降了17.53%,LSTre-2的表达量下降了41.53%；dsGFP处理对海藻糖酶的酶活力没有显著影响,而喂食含dsTre-1和dsTre-2饲料的试虫,其海藻糖酶的酶活力与对照相比分别下降了25.27%和25.06%,这说明该方法有效沉默了灰飞虱海藻糖酶基因的表达,并产生了致死效应。4.证实干扰灰飞虱海藻糖基因能引起致死效应的基础上,进一步研究干扰灰飞虱海藻糖酶基因对灰飞虱正常生长发育的影响。结果表明,dsGFP处理对试虫的体重没有显著影响,而喂食含dsTre-1和dsTre-2饲料的试虫体重较对照组体重显著减轻,这直接证明了沉默海藻糖酶基因使其mRNA表达量和酶活力下降时,不仅能能引起致死效应,还可导致灰飞虱的正常生长发育受阻。