研究背景和目的 肝硬化是肝纤维化的进展阶段,是慢性肝病共同的病理过程,属于发病率和死亡率均较高的疾病。门静脉高压(portal hypertension,PHT)是肝硬化最常见和最严重的并发症,可导致严重的临床问题,例如曲张静脉破裂出血、腹水和肝性脑病等。肝硬化门脉高压及其并发症是慢性肝病患者死亡和需要肝移植的首要原因。能够延缓甚至逆转肝硬化的药物,对于延长肝硬化患者的生存时间,改善患者的生活质量,具有重要的临床意义。近些年来关于肝硬化门脉高压发病机制的研究取得了极大的进展。PHT的发病机制包括两方面:一是起始因素,即肝内血管阻力(intrahepatic vascular resistance,IHVR)的增加;二是维持因素,即门静脉血流的增加。IHVR的增加由结构性因素和功能性因素两方面因素导致。其中,肝纤维化、再生结节形成及肝窦重构等是导致肝硬化IHVR增加的重要的结构性因素,而肝窦重构最显著的特点是“肝窦毛细血管化”。肝硬化最明显的特点是过多细胞外基质(extracellular matrix,ECM)在肝内异常沉积,一方面通过瘢痕、再生结节形成及纤维结缔组织增生,使肝内解剖结构紊乱,肝脏静脉系统受压,使IHVR增加;另一方面ECM过多沉积于肝窦内皮细胞(liver sinusoidal endothelial cells,LSECs)内皮下,形成连续的基底膜,称为“肝窦毛细血管化”,从而促进肝硬化和PHT的进展。多种类型的细胞和细胞因子参与了肝纤维化、肝硬化和PHT的发病和进展。其中,肝星状细胞(hepatic stellate cells,HSCs)是最重要的效应细胞。在肝损害因素的作用下,处于静息状态的HSCs转化为肌成纤维样细胞表型,活化的HSCs有以下特征:增殖、迁移至损伤部位、产生大量的ECM蛋白、分泌促纤维化因子等。LSECs产生ECM蛋白例如纤维连接蛋白(fibronectin,FN),并分泌促纤维化细胞因子例如转化生长因子β1(transforming growth factor β1,TGF-β1)和血小板源生长因子(platelet-derived growth factor,PDGF)等,不仅仅促进HSCs活化,而且参与肝窦毛细血管化,从而在肝纤维化、肝硬化和PHT的进程中也起到了重要的作用。TGF-β1通路是肝纤维化过程中最重要的信号通路之一,而且TGF-β1是肝脏内最强的促进纤维化的细胞因子,能够促进HSCs和LSECs合成多种ECM蛋白。TGF-β1的信号通路主要分为两大类:Smad依赖性信号通路,即与Smads家族相关的通路;非Smad依赖性信号通路,主要包括磷脂酰肌醇-3-激酶/蛋白激酶 B(phosphatidylinositol-3-kinase/protein kinase B,PI3K/AKT)、细胞外信号调节蛋白激酶(extracellular signal-regulated kinase,ERK)等信号通路。卡维地洛是新型的强效的β受体阻滞剂(non-selvective beta blocker,NSBB),同时具有α1肾上腺素能受体拮抗活性,被广泛应用于心血管领域中。卡维地洛具有抗增殖、抗炎、抗氧化及抗血管生成等作用,因此与传统的NSBBs相比具有更多的优势。NSBBs能有效降低门静脉压力,是预防曲张静脉破裂出血的一线药物。研究表明,与传统的NSBBs(普萘洛尔和纳多洛尔)相比,卡维地洛能更有效地降低肝静脉压力梯度(hepatic venous pressure gradient,HVPG)。卡维地洛主要是通过降低门脉血流量(PHT的维持因素)从而降低门静脉压力,尚未发现IHVR(PHT起始因素)的结构性因素参与其降低门静脉压力的作用中。研究发现卡维地洛能改善心肌纤维化和心肌重构,并且能改善肾脏纤维化和血管重构。因此我们推测卡维地洛有可能改善导致IHVR增加的结构性因素,从而降低门静脉压力。本研究首先探讨了四氯化碳(carbon tetrachloride,CCl4)诱导的肝硬化大鼠中的治疗作用。动物实验证实卡维地洛能够抑制HSCs的活化,减少肝脏内ECM沉积,改善肝硬化大鼠的肝脏结构紊乱、肝纤维化和肝窦毛细血管化,并降低门静脉压力,表明卡维地洛改善了导致IHVR增加的结构性因素,并降低门静脉压力。为了进一步探讨卡维地洛改善导致IHVR增加的结构性因素的机制,本研究在体外实验以HSC细胞系LX-2、原代LSECs和脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells,HUVECs)为研究对象。细胞实验表明卡维地洛能够抑制HSCs的活化、增殖和侵袭,并通过抑制TGF-β1/Smads通路抑制HSCs、LSECs和HUVECs合成ECM蛋白。以上结果表明,卡维地洛能够抑制HSC的活化、增殖和侵袭,并且抑制HSCs和LSECs合成ECM蛋白,从而改善导致IHVR增加的结构性因素。目前卡维地洛主要用于降低肝硬化失代偿期患者的门静脉压力,预防曲张静脉破裂出血。我们认为,卡维地洛能够作用于PHT起始因素(IHVR的增加)中的结构性因素,降低门静脉压力,因此卡维地洛在慢性肝病中的临床应用不应局限于肝硬化失代偿期,若应用于慢性肝病的早期阶段,可能使患者受益更多,这具有重要的意义。第一部 卡维地洛改善肝硬化大鼠肝内血管阻力的结构性因素并降低门静脉压力目的验证卡维地洛在CCl4诱导的肝硬化大鼠中的治疗作用。方法雄性Wistar大鼠随机分为3组:对照组、肝硬化组和卡维地洛治疗组。对照组大鼠每周2次腹腔注射橄榄油;肝硬化组大鼠每周2次腹腔注射CCl4构建肝硬化大鼠模型;卡维地洛治疗组大鼠在腹腔注射CCl4的同时,每天给予卡维地洛灌胃治疗。腹腔注射CCl4 9周后,称量各组大鼠的体重并记录,然后在麻醉下测量门静脉压力并记录数值。收集各组大鼠的血液标本,测定血清中谷丙转氨酶(alanine aminotransferase,ALT)、谷草转氨酶(aspartate aminotransferase,AST)和白蛋白(albumin,ALB)水平。收集各组大鼠的肝脏标本,采用苏木精-伊红(hematoxylin-eosin,HE)染色进行肝脏组织检查,天狼猩红(sirius red,SR)染色观察肝内ECM沉积程度,免疫组织化学(Immunochemistry,IHC)和Western blot检测肝纤维化相关指标例如α-平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA)和FN,并采用透射电镜观察LSECs内皮下ECM沉积情况。结果1.肝硬化大鼠的体重较对照组大鼠的体重明显降低,卡维地洛使CCl4诱导的大鼠的体重进一步下降。2.肝硬化大鼠的血清中AST和ALT均升高、ALB降低,卡维地洛抑制了CCl4诱导的大鼠血清中AST和ALT的升高,但未改善ALB水平。3.肝硬化大鼠的门静脉压力明显升高,卡维地洛减轻了 CCl4诱导的大鼠门静脉压力的升高。4.肝硬化大鼠的肝内结构紊乱,卡维地洛改善了 CCl4诱导的大鼠肝内结构紊乱。5.肝硬化大鼠的肝内见大量ECM沉积,卡维地洛明显减轻了 CCl4诱导的大鼠肝内ECM沉积。6.肝硬化大鼠的HSCs明显活化,卡维地洛抑制CCl4诱导的大鼠HSCs的活化。7.肝硬化大鼠的LSECs内皮下可见大量ECM沉积,形成连续的基底膜,卡维地洛明显减轻了 CCl4诱导的大鼠LSECs内皮下ECM沉积,从而改善了肝窦毛细血管化。结论卡维地洛抑制HSCs的活化和ECM合成,改善了肝硬化大鼠的肝脏结构紊乱、肝纤维化及肝窦毛细血管化,从而改善了导致IHVR增加的结构性因素,并降低了门静脉压力。第二部分卡维地洛抑制肝星状细胞的增殖、侵袭、活化和细胞外基质蛋白的合成目的 研究卡维地洛对HSCs增殖、侵袭、活化和ECM蛋白合成的影响。方法1.体外培养人HSCs系LX-2。2.CCK-8实验检测卡维地洛对HSCs增殖的影响。3.Transwell实验检测卡维地洛对HSCs侵袭能力的影响。4.免疫荧光(Immunofluorescence,IF)检测FN蛋白在HSCs胞浆中的表达。5.Western blot检测卡维地洛对HSCs活化及ECM蛋白合成的影响,并探讨其分子机制。结果1.卡维地洛抑制了 HSCs增殖。2.卡维地洛抑制了 HSCs侵袭。3.卡维地洛抑制了 HSCs的活化。4.TGF-β1刺激HSCs合成ECM蛋白增加,而卡维地洛抑制了 TGF-β1诱导的HSCs中ECM蛋白表达上调。5.TGF-β1能上调HSCs中Smad2和Smad3的磷酸化水平,而AKT和ERK的磷酸化水平无明显改变,总的Smad4蛋白水平亦无明显变化。6.卡维地洛抑制了 TGF-β1诱导的Smad2和Smad3磷酸化水平的上调。应用SIS3验证了卡维地洛通过抑制TGF-β1/Smads通路而抑制了 TGF-β1诱导的ECM蛋白表达上调。结论卡维地洛抑制HSCs增殖、侵袭、活化,并且通过抑制TGF-β1/Smads通路而抑制了 HSCs合成ECM蛋白,从而改善了肝硬化大鼠中导致IHVR增加的结构性因素。第三部分卡维地洛抑制肝窦内皮细胞中纤维连接蛋白的合成目的研究卡维地洛对LSECs合成纤维连接蛋白的作用。方法1.体外培养原代人LSECs和HUVECs(利用细胞系HUVECs摸索实验条件,再在原代LSECs中验证卡维地洛的作用)。2.IF染色检测FN蛋白在LSECs和HUVECs胞浆中的表达。3.实时定量聚合酶链反应(quantitative real-time polymerase chain reaction,qTR-PCR)研究卡维地洛对TGF-β1诱导的LSECs和HUVECs中FNmRNA表达的影响。4.Western blot研究卡维地洛对TGF-β1诱导的LSECs和HUVECs中FN蛋白表达的影响,并探讨其分子机制。5.应用抑制剂探索卡维地洛抑制TGF-β1诱导的LSECs和HUVECs合成FN蛋白的信号通路。结果1.IF染色证实FN蛋白在LSECs和HUVECs的胞浆内表达。2.TGF-β1上调LSECs和HUVECs中FN mRNA和蛋白的表达。3.卡维地洛抑制了 TGF-β1诱导的LSECs和HUVECs中FN mRNA和蛋白表达的上调。4.TGF-β1诱导LSECs中Smad2和Smad3的磷酸化水平上调,而TGF-β1诱导HUVECs中ERK、Smad2和Smad3的磷酸化水平上调。5.卡维地洛抑制了 TGF-β1诱导的LSECs中Smad2和Smad3磷酸化水平的上调,抑制了 TGF-β1诱导的HUVECs中ERK、Smad2和Smad3磷酸化水平的上调。6.抑制剂(SIS3和PD98059)验证了:在LSECs和HUVECs中,卡维地洛通过抑制TGF-β1/Smads通路而抑制了 TGF-β1诱导的FN蛋白表达的上调。结论卡维地洛通过抑制TGF-β1/Smads通路而抑制了 TGF-β1诱导的LSECs中FN蛋白合成,减轻肝纤维化和肝窦毛细血管化,从而改善了肝硬化大鼠中导致IHVR增加的结构性因素。