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本研究对马铃薯甲虫黑色素合成相关的20个基因进行了克隆、多重序列比对和系统发育分析,通过qPCR技术,对其进行了时空表达分析,并初步研究了其对保幼激素和蜕皮激素的响应机制,重点利用RNA干扰对Ld-tan、Ld-ebonyl、Ld-ebony2、Ldyellow-f1、Ldyellow-f2、Ldyellow-y这6个基因,研究其在幼虫生长发育过程中的功能,并对这6个基因受控于激素的调节机制进行了初步阐述,最后尝试利用dsLd-ebony1的发酵菌液进行田间防控并作初步的效果评价。主要获得了以下的结果:1、马铃薯甲虫黑色素相关基因的克隆利用黑腹果蝇和赤拟谷盗的NBAD水解酶基因(Tαn)、NBAD合成酶基因家族(Ebony)、黄体基因(Yellow)家族,分析马铃薯甲虫的转录组和基因组数据,通过相似性搜索软件Blast搜索获得了马铃薯甲虫的Tan、Ebonyl、Ebony2以及17个Yellow家族基因,17个基因分属于c亚族(c1,c2),d亚族(d1,d2,d3),e亚族(e1,e2),f 亚族(f1,f2),g 亚族(g1,g2),h 亚族,x 亚族(x2,x3,x4,x6)和 y家族。通过提取马铃薯甲虫的总RNA,cDNA第一链的合成和PCR等一系列分子生物学技术,克隆获得了上述20个基因的全长cDNA,并提交至NCBI获返还GenBank登录号。2、马铃薯甲虫黑色素相关基因的序列比对和系统发育分析通过对马铃薯甲虫,黑腹果蝇和赤拟谷盗等相应基因的蛋白质序列的多重比对,发现马铃薯甲虫的相应基因具有昆虫本身具有的经典结构域,通过系统发育聚类分析,马铃薯甲虫的黑色素合成途径基因分别与赤拟谷盗的和山松大小蠹分别聚类,相似性最高,由此将马铃薯甲虫的这些基因分别命名为Ld-tan、Ld-ebony1、Ld-ebony2、Ldyellow-c1、Ldyellow-c2、Ldyellow-d1、Ldyellow-d2、Ldyellow-d3、Ldyellow-e1、Ldyellow-e2、Ldyellow-f1、Ldyellow-f2、Ldyellow-g1、Ldyellow-g2、Ldyellow-h、Ldyellow-x2、Ldyellow-x3、Ldyellow-x4、Ldyellow-x6、Ldyellow-y。3、马铃薯甲虫黑色素相关基因的时空表达谱组织表达和龄期表达的定量分析发现:(1)组织表达对马铃薯甲虫四龄幼虫各个组织和成虫的生殖腺中测定相对表达量,结果表明这20个基因在各个组织中均有表达,但表达模式均有不同,即使是同源基因,两两基因之间的表达也有差异。(2)龄期表达通过qPCR技术测定了马铃薯甲虫20个基因的龄期表达模式,发现Ld-tan,Ld-ebonyl,Ldebony-2在低龄幼虫期和蛹期表达较低,在高龄幼虫和成虫期表达较高,而yellow家族在幼虫低龄期表达较高,而在幼虫高龄期、蛹期和成虫期表达较低。马铃薯甲虫体色相关基因受保幼激素、蜕皮激素调控模式。4、马铃薯甲虫黑色素相关基因与保幼激素、蜕皮激素的交叉对话通过RNAi降低保幼激素合成基因LdJHAMT,保幼激素静止激素LdAS-c、保幼激素受体LdMet,蜕皮激素合成相关P450基因Ldphm和Ldshd,蜕皮激素受体LdEcR和其信号转导基因Ldhr3的表达量,检测了敲低这些基因后对这20个体色相关基因表达的影响。结果发现Ld-tan可能受蜕皮激素的负向调控,保幼激素的正向调控。Ld-ebony1与Ld-ebony2可能受蜕皮激素的正向调控。Yellow家族则受保幼激素的影响较大。5、RNAi敲低6个黑色素合成途径基因后对马铃薯甲虫生长发育的影响通过喂食二龄初幼虫敲低靶标基因Ld-tan时,检测到试虫的各组织中表达量下降,同时幼虫出现一定程度的死亡率,对发育历期,化蛹率,羽化率并无显著影响。在处理幼虫发育至四龄中末期时幼虫体色呈深棕褐色而降低Ld-ebonyl和Ld-ebony2,则表现为显著的致死率,幼虫呈黑褐色且出现黑斑虫体干缩,大部分不能按期正常入土化蛹,易形成黑化蛹,致使不能正常羽化。Ldyellow-f1、Ldyellow2、Ldyellow-y对虫体的致死率、化蛹和羽化率均无显著性差异,处理的幼虫发育至高龄时体色呈金黄色,其中处理Ldyellow-y体色变异肉眼最易辨认。6.dsRNA发酵菌液的田间防控尝试根据RNAi的结果发现dsebony-1和dsebony-2的对幼虫具有一定的致死率,将dsRNA发酵菌液的稀释10倍后直接喷施于盆栽马铃薯上,发现喷施后具有一定的防控效果,防控时间可达14天以上。