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哺乳动物的RNA有100余种转录后修饰,其中腺嘌呤第6位氮原子上的甲基化修饰(N~6-methyladenosine,m6A)是真核生物的mRNA中最常见的修饰形式。有文章表明,m6A修饰能通过调控mRNA的稳定性进而影响多能因子的转录水平,并且能够调控小鼠多能干细胞的细胞重编程与表观遗传状态。METTL3作为m~6A甲基转移酶复合物中的重要组分,在胚胎干细胞和诱导多能干细胞的干性维持、细胞重编程、胚胎发育等过程中发挥重要作用。本研究旨在揭示猪METTL3的表达模式,构建METTL3的超表达和干扰载体,研究其表达变化对猪干细胞多能性的调控作用。通过在猪多能干细胞培养基中添加m~6A甲基化抑制剂环亮氨酸培养细胞,发现试验结果与干扰METTL3表达的结果一致。本研究为优化猪多能干细胞的培养体系提供了新的依据。本研究获得的主要结果如下:1.猪METTL3的表达谱和分子克隆用RT-PCR检测猪的13种组织和器官(胃、皮肤、心脏、脂肪、肌肉、小肠、大肠、子宫、肝脏、肺、脾脏、肾脏、脑)、体细胞(PEF、PK-15)、多能干细胞(DOX-iPS、PS11、PS23)等中的METTL3表达情况。结果表明,METTL3在猪的不同组织、器官和细胞中广泛表达。从猪的基因组中成功克隆了1 859 bp的METTL3基因的编码序列片段,并构建了表达载体pEGFP-METTL3,经酶切鉴定正确,并在蛋白水平检测到融合蛋白的表达,免疫荧光染色结果显示了EGFP-METTL3融合蛋白定位在细胞核中。2.METTL3对猪干细胞多能性的影响克隆了猪METTL3编码区序列后,本实验设计了METTL3干扰片段,并构建了相应的慢病毒超表达和干扰载体,通过转染HEK293T细胞包装病毒,感染猪多能干细胞。结果发现,超表达METTL3后,细胞形态未发生显著变化,细胞碱性磷酸酶活性降低,多能基因OCT4和LIN28A的表达水平变化不显著。干扰METTL3的表达后,猪多能干细胞出现类似na?ve状态的细胞克隆,细胞碱性磷酸酶活性升高,多能基因NANOG、OCT4和LIN28A的表达水平显著升高。3.环亮氨酸对猪干细胞多能性的影响在DOX-iPS细胞培养液中分别添加10 mmol/L和20 mmol/L的环亮氨酸,结果显示,DOX-iPS在20 mmol/L环亮氨酸培养基中培养,细胞克隆形态松散,并且生长速度缓慢。因此,配制了2 mmol/L、4 mmol/L、10 mmol/L三个浓度的环亮氨酸培养基,分别培养DOX-iPS 24 h和48 h。结果显示,24 h和48 h的细胞克隆形态均未出现明显改变,而48 h后10 mmol/L实验组的碱性磷酸酶活性强于其他组,并且细胞中的多能基因NANOG、OCT4和LIN28A的表达量显著高于其他处理组。这说明添加一定浓度(10 mmol/L)环亮氨酸,使猪多能干细胞内源性多能基因的表达水平显著提高。综上所述,本研究揭示了猪METTL3基因的表达模式,克隆了猪METTL3基因的编码序列片段,构建了猪METTL3基因的超表达和干扰载体,确认了METTL3的表达对猪干细胞中多能基因表达的调控作用,即降低METTL3表达或添加环亮氨酸能够显著提高猪干细胞内源性多能基因的表达水平,有助于猪干细胞多能性的维持。