论文部分内容阅读
嵌合抗原受体T细胞(CAR-T,chimeric antigen receptor T cell)技术被业界认为是一个革命性和颠覆性的最有潜力治愈血液肿瘤的技术,但因CAR-T回输后所引起的严重细胞因子释放综合征(severe cytokine release syndrome,sCRS)和严重的CAR-T相关的脑病(severe CAR-T related encephalopathy,sCRES)而导致的临床安全风险以及CAR-T治疗后短期复发问题,是目前严重阻碍CAR-T临床应用和推广的两大主要痛点。本课题针对这两大问题分别进行了研究,为迫切解决CAR-T临床应用的两大痛点提供新的思路和策略。本课题第一部分是针对在CAR-T治疗难治复发急性B淋巴细胞白血病(relapse and refractory B acute lymphoblastic leukemia,r/r B-ALL)中出现的sCRS和sCRES反应而造成的CAR-T临床安全性问题,通过探讨IL-6细胞因子在sCRS和sCRES发生和发展机制中的作用,成功设计和构建了分别表达靶向CD19抗原的CAR基因表达框和IL-6shRNA基因沉默元件的新一代CAR载体(ssCAR),并在细胞水平考察了转导后携带IL-6shRNA元件的ssCART-19对IL-6表达和分泌的影响,以及其对单核细胞释放IL-6的影响;并进一步评估了其体内、体外抗肿瘤的活性。实验表明:传统的CART-19细胞在被CD19+的靶细胞激活后,其内源性IL-6基因在mRNA和蛋白质的表达水平分别增加了4倍和20倍。与传统的CART-19相比,ssCART-19能显著下调IL-6在mRNA和蛋白水平的表达和分泌量达70%左右,并且能持续有效降低单核细胞IL-6因子的释放;进一步的研究发现,IL-6shRNA介导的IL-6基因沉默并未影响ssCART-19的基本特性以及体内和体外的增殖和杀伤能力。本课题设计的新一代ssCART-19有望减少由IL-6分泌的迅速升高而引起的sCRS和sCRES的发生,为解决目前CAR-T临床治疗中出现的安全性的瓶颈问题提供了独特的新思路和策略。第二部分是针对CAR-T治疗多发性骨髓瘤(relapse and refractory multiple myeloma,r/r MM)后短期出现复发的问题。抗原逃逸和肿瘤干细胞是CAR-T治疗MM后复发的主要原因。本课题在慢病毒载体上通过串联的方法把两个单链抗体(single chain antibody,scFv),scFv-CD19和scFv-BCMA,以串联的方式连接在同一个CAR分子(tandem-CAR,tan-CAR),转导后的tan-CART细胞,能被靶细胞上CD19或者BCMA任何一个抗原激活。进一步体内研究显示,激活后的tan-CART能显著杀伤携带两种抗原的肿瘤细胞,并有效抑制由两种肿瘤细胞构建的动物模型的疾病进展,而在相同两种肿瘤细胞构建的动物模型中,靶向单一抗原的CAR-T细胞无法抑制疾病的进展。这种通过单个CAR分子上具有两种单链抗体的结构赋予T细胞具有识别和杀伤两种抗原表达的MM细胞或者MM肿瘤干细胞的能力,为提高CAR-T治疗r/r MM患者的疗效并延长缓解时间,提高病人的长期生存率提供了新的解决方案。综上:本课题针对CAR-T在临床治疗中所面临的安全风险和疗效时间短的两大痛点,首次成功设计和构建了既能降低CAR-T临床风险又能保持疗效的IL-6shRNA修饰的新一代ssCART-19和具有同时靶向双抗原能力的tan-CART细胞技术;为提高CART治疗r/r B-ALL安全性和提高r/r MM临床有效性和提高缓解率,延长缓解时间提供了独特和新颖的思路和策略。