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目的:研究中药香加皮提取物宝霍甙-Ⅰ体外对食管癌细胞株Eca-109增殖活性和凋亡的影响,以及β-catenin-survivin-caspase3/7通路在宝霍甙-Ⅰ诱导食管癌细胞凋亡过程中的作用,为中药香加皮的开发利用提供科学依据。
方法:
1采用MTT法分析不同浓度宝霍甙-Ⅰ作用不同时间后,对Eca-109细胞增殖活性的影响,选择最适药物浓度和作用时间进行后续实验。
2经AO/EB染色,应用荧光显微镜观察不同浓度(Oμg/ml、5μg/ml、10μg/ml、20μg/ml、40μg/ml)宝霍甙-Ⅰ处理Eca-109细胞48h后,细胞的形态学变化。
3不同浓度(Oμg/ml、5μg/ml、10μg/ml、20μg/ml、40μg/ml)宝霍甙-Ⅰ作用于Eca-109细胞48h,经PI单染后用流式细胞术(FCM)检测细胞凋亡率。
410-40μg/ml宝霍甙-Ⅰ处理Eca-109细胞24h后,用RT-PCR法检测Wnt/β-catenin信号转导通路中GSK-3β、CK1和Axin mRNA和天冬氨酸特异性的半胱氨酸蛋白水解酶caspase3、caspase7 mRNA表达的影响。
5 Western—Blot法检测用不同浓度(10ug/ml、20μg/ml、40μg/ml)宝霍甙-Ⅰ作用于Eca-109细胞24h后,对β-catenin和磷酸化β-catenin、survivin蛋白表达的影响。
6比色法检测宝霍甙-Ⅰ作用于Eca-109细胞后,caspase3/7活性的变化。
结果:
1 MTT检测结果显示,经10—40μg/ml宝霍甙-Ⅰ作用48h后,能明显抑制Eca-109细胞的增殖活性,与培基对照组相比有显著性差异(P<0.01),并呈浓度及时间依赖性。而5μg/ml的宝霍甙-Ⅰ对Eca-109细胞增殖活性未见明显影响(P>0.05)。
2经AO/EB染色和荧光显微镜观察发现,经10-40μg/ml宝霍甙-Ⅰ作用48h后,Eca-109细胞细胞染色增强,荧光明亮,20、40μg/ml处理组细胞出现橙黄色荧光,对照组细胞呈现均匀的绿色荧光。
3流式细胞术检测结果显示,10-40μg/ml宝霍甙-Ⅰ作用48h后,Eca-109细胞凋亡比例均增加,与对照组相比有统计学差异(P<0.01)。
410-40μg/ml宝霍甙-Ⅰ处理24h后,Eca-109细胞GSK-3β、AxinmRNA表达增加,β-catenin mRNA表达下降(P<0.01),均呈浓度依赖性。
510-40μg/ml宝霍甙-Ⅰ作用24h后,Eca-109细胞磷酸化β-catenin蛋白表达水平升高,β-catenin和survivin蛋白表达水平均降低(P<0.01)。
610—40μg/ml宝霍甙-Ⅰ作用24h后,Eca-109细胞caspase3、7 mRNA表达未发生变化,caspase3/7活性升高(P<0.01)。
结论:
1宝霍甙-Ⅰ在体外可明显抑制Eca-109细胞的增殖活性,并且可诱导Eca-109细胞凋亡,呈浓度依赖性。
2宝霍甙-Ⅰ诱导食管癌Eca-109细胞凋亡,其作用机制可能与调节β-catenin—survivin—caspase3/7通路分子如GSK-3β、Axin、β-catenin、survivin、caspase3、7 mRNA及蛋白表达活性相关。