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本文在制备人肝再生增强因子转基因绵羊的上游工程中，利用绿色荧光蛋白作为选择标记，通过体细胞核移植技术建立细胞、胚胎水平上的转基因阳性筛选体系。该体系的建立在生产转基因绵羊的过程中可减少代孕母畜数量，降低成本，提高转基因效率。 1．绿色荧光蛋白和人肝再生增强因子基因真核表达载体的构建 利用分子生物学技术分别从人和绵羊基因组DNA中克隆了人肝再生增强因子（Human of liver regeneration, ALR）基因组DNA和绵羊β-乳球蛋白（β-lactoglobulin,BLG）基因5’端0.8kb DNA序列，从pEGFP-C1质粒中克隆了增强绿色荧光蛋白（Enhance green fluorescent protein, EGFP）基因及其表达调控元件，构建了以下三种真核表达载体：（1）ALR基因乳腺特异表达，EGFP基因非组织特异性表达载体，pGEM-BAE。（2）ALR和EGFP基因双顺反子表达载体，pIRES-EGFP／ALR。（3）ALR和EGFP融合基因表达载体，pEGFP／ALR。经PCR和酶切检测，证明载体构建正确，为下一步转基因绵羊的研究奠定了基础。 2．绵羊胎儿成纤维细胞的分离培养及转基因条件的优化 取6个30天左右的绵羊胎儿，从中成功分离、培养了绵羊胎儿成纤维细胞（sheep fetal fibroblast cells, sFFCs）。测定了sFFCs的G418敏感浓度，sFFCs的G418筛选浓度为800ug／ml，维持浓度300ug／ml。另外分别优化了两种转染试剂LipofectAMINETM和Fegene-6转染sFFCs的条件，比较了DNA纯度、浓度、转染试剂用量及细胞暴露于DNA、转染试剂中作用时间对转染效率的影响，LipofectAMINETM转染sFFCs较为适宜的条件是，LipofectAMINETM10ul, DNA 2ug, 马玉珍用绿色荧光蛋白和肝再生增强因子基因进行转基因绵羊胚胎的研究共作用时间shr，转染效率为每视野42个荧光细胞，Fegene一6转染SFFCs较为适宜的条件，Fegene一6 6ul，DNA Zug，共作用时间12hr。转染效率为每视野19个荧光细胞。转染结果表明:对于绵羊胎儿成纤维细胞，LipofectAM工NE丁“转染效率较好，为目的基因转染SFFCS提供了参考依据。 3.绿色荧光蛋白对绵羊胎儿成纤维细胞生物学特性的影响及绵羊胎儿成纤 维细胞性别鉴定 LipofeetAMINETM介导pEGFP一Cz转染体外培养的6只绵羊胎儿SFFCS，经G418筛选12天，挑选发绿色荧光的单克隆细胞扩大培养23天（转基因后共培养35天），进行细胞形态观察、生长曲线以及染色体核型分析。结果表明，整合有EGFP基因的SFFCS与对照组细胞比较，在细胞形态、生长曲线、染色体正确核型率上无明显差别。同时利用PCR方法对体外培养的6只绵羊胎儿的SFFCS进行性别决定区（seX determining region of、hey，sRY）基因检测，以明确SFFCs性别。结果显示:6只绵羊胎儿成纤维细胞中，其中2只为雌性胎儿细胞、4只为雄性胎儿细胞，对SRY基因的分析与染色体分析结果一致，明确了sFFCS的性别，可通过体细胞核移植进行己知性别的转基因克隆绵羊的研究。 4.绿色荧光蛋白和肝再生增强因子融合基因在绵羊胎儿成纤维细胞中的表达 利用LipofectAMINE，加介导线性化pEGFP/ALR质粒转染SFFCS。经G418筛选，10d后共形成38个单克隆细胞，其中23个克隆发荧光，15个克隆不发荧光。挑选3个荧光细胞克隆和3个不发荧光的细胞克隆扩大培养，用PCR、聚丙烯酸胺凝胶电泳及免疫组化检测。结果表明:3个荧光单克隆细胞均有ALR、Neor基因的PCR产物，聚丙烯酞胺凝胶电泳可见57KD大小的融合蛋白，免疫组化检测到ALR蛋白分布于SFFCS胞质和胞核，且胞核含量多于胞质;3个非荧光单克 内蒙古大学博士学位论文隆细胞中不仅有ALR、EGFP、Neor基因PCR条带，而且其中的1个克隆还有融合蛋白。荧光显微镜下观察到绿色荧光蛋白在sFFCS中的分布与ALR分布一致。由此可见，ALR、EGFP融合基因能够在SFFCS中表达，通过绿色荧光可确定ALR在细胞内的表达部位。 5 .EGPP和ALR双顺反子表达载体转染绵羊胎儿成纤维细胞及体细胞克隆产 生转基因囊胚 以Lipofe。tAMINE仪介导线性化pIRES一EGFP/ALR质粒转染sFFCs，经G418筛选，12天后形成43个细胞单克隆，其中发荧光的27个。挑选其中的3个荧光细胞单克隆进一步扩大培养，分别进行PCR、RT一PCR及免疫组化检测。结果表明:ALR基因在荧光单克隆细胞中存在并表达，而且与EGFP同时表达。取其中1株荧光单克隆细胞饥饿培养，进行绵羊的体细胞核移植，结果显示:对146个卵母细胞进行核移植，得到45个8细胞期胚胎，其中14个发育到囊胚阶段，激光共聚焦显微镜下观察囊胚中的每个细胞均发出绿色荧光，并检测到囊胚中有ALR蛋白的表达。由此说明EGFP、ALR在细胞和胚胎水平上同时表达。建立了一套胚胎移植前高效的体细胞核移植筛选系统。 6.原核显微注射法制备转基因绵羊胚胎 本研究利用原核显微注射法将线性化的pGEM一BAE DNA注射于182枚绵羊受精卵原核中，体外发育培养48hr，荧光显微镜下观察，可见5枚荧光胚胎，表明所构建载体中 EGFP能够作为标记基因进行转基因阳性胚胎筛选，为进一步生产乳腺特异性表达ALR的转基因