【摘 要】
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人类大脑是一个极端复杂的结构,不仅拥有近千亿个神经元,并包含多种神经元类型。不同类型神经元拥有不同生物学特性,并且执行不同功能。然而它们在脑中分布相互混合、形态交错、分子表达多重复杂,彼此难以区分,这对于脑科学研究是一个巨大的挑战。对特定类型神经元的精准标记是解析复杂脑结构和脑功能的必要前提。然而,依赖Cre-driver转基因小鼠的传统标记方法往往只能标记出表达相应基因型的神经元群,而对该类神经
【基金项目】
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华中科技大学人才引进基金基金（NO.3004187125）；
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人类大脑是一个极端复杂的结构,不仅拥有近千亿个神经元,并包含多种神经元类型。不同类型神经元拥有不同生物学特性,并且执行不同功能。然而它们在脑中分布相互混合、形态交错、分子表达多重复杂,彼此难以区分,这对于脑科学研究是一个巨大的挑战。对特定类型神经元的精准标记是解析复杂脑结构和脑功能的必要前提。然而,依赖Cre-driver转基因小鼠的传统标记方法往往只能标记出表达相应基因型的神经元群,而对该类神经元群的不同亚群的精准区分还存在一定的难度。为了解决这一问题,本文建立了一种基于CRISPR/Cas9介导的重组酶整合系统,我们称之为CRISPRMap系统。该系统结合Cre-driver转基因小鼠,能实现对特定神经元亚群的精准标记。本文主要研究内容如下:（1）为了筛选严谨的,能用于CRISPR-Map标记系统的载体工具,本文构建了三种不同结构的Dre供体质粒,并通过比较实验,最终确定供体质粒p L-Stop-i Dreg RNA及其包装的供体病毒AAV-Stop-i Dre-g RNA具有高的严谨性,可以潜在应用于此研究的标记系统。（2）通过标记小鼠背侧纹状体（caudate-putamen,Cpu）表达1型多巴胺受体的中型多棘神经元（dopamine receptor D1 expressing medium spiny neurons,Drd1-MSNs）的抑制性亚群（Drd1+/Gad1+神经元）,对CRISPR-Map标记系统进行测试。实验结果证实,CRISPR-Map系统能用于特异性标记特定类型神经元亚群。（3）通过降低Dre供体病毒滴度,利用CRISPR-Map标记系统实现了对Drd1+/Gad1+神经元的稀疏标记;并且利用该标记系统分别标记了Sst中间神经元的Chod1和Esm1两个亚型,实验结果显示该标记系统标记的神经元结构清晰,适用于进一步研究特定类型神经元亚型的单神经元结构。综上所述,本文建立了一种基于CRISPR/Cas9介导的重组酶整合系统,即CRISPR-Map系统,能特异性标记特定类型神经元亚群。该标记系统可以大大减少对转基因鼠的依赖,对于现有的神经元标记方法是一个很好的补充,为将来进一步解析特定类型神经元亚群的结构和功能奠定了坚实基础。
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