目的氟是人体所必需的微量元素,对人体健康具有双重作用,适量的氟是人体必需的,是构成骨骼和牙齿的重要成分,并且能够促进生长发育和生殖功能。长期大量摄入氟可引起氟中毒,主要表现为氟斑牙和氟骨症。铝是地球上含量最丰富的一种金属,低剂量的铝可刺激骨细胞的增殖和分化,而人体长期摄入铝,在体内蓄积后会引起神经退行性疾病、骨软化和贫血等铝中毒性疾病。研究表明,Al+和F-结合能力比其它60多种金属离子都要强,在酸碱度呈中性条件下,氟化物可与铝离子形成氟化铝,主要形成AlF3和AlF4,AlFx是G蛋白激活因子,与多种酶的激活有关。在氟病区,铝厂、铝矿工人在日常生产活动中,除了接触大量的铝以外,同时还暴露于高氟环境。饮水型氟中毒病区采用铝盐除氟,也造成当地饮用水中氟铝共存现象。很多速食食品中也都同时检出氟、铝含量超标。茶树有强烈富集氟、铝元素的性质,树体内的氟、铝主要富集于成熟叶与老叶中,可高达1,175mg/kg和4,381mg/kg,因此往往导致成熟叶和老叶加工的砖茶中氟、铝含量严重超标,造成饮茶性氟中毒。既往流行病学和动物实验研究发现氟能促进铝在骨骼中蓄积,铝能加重氟中毒的危害,因此饮茶性氟中毒病区的人群骨相损害往往比较严重。所以研究氟铝联合的作用具有重要的现实意义与科研价值。成骨细胞由骨内膜和骨外膜深层以及骨髓的骨祖细胞分化而成。在膜内成骨和软骨内成骨中,充质细胞(MSCs)分化为成骨细胞同时分泌细胞外基质(ECM),随着ECM的钙化,成骨细胞被包埋在骨质中成为骨细胞。其发育和分化可简括为如下几个阶段：间充质干细胞(mesenchymal stem cell)→祖细胞(progenitor cell)→前成骨细胞(preosteoblast)→成熟成骨细胞(mature osteoblast)→骨细胞(osteocyte)。小鼠颅顶前骨细胞亚克隆14 (MC3T3-E1 Subclone 14),是从小鼠的颅顶骨细胞建株的前成骨细胞系,具有ALP活性、Ⅰ型胶原酶合成能力和基质钙化等成骨细胞典型的生物学活性。本研究利用MC3T3-E1细胞系研究不同剂量氟、铝和氟铝联合染毒后对MC3T3-E1细胞的增殖和分化能力的影响,并探讨氟铝联合染毒后对核心结合因子-al(Runx2)、Osterix、骨保护素(Osteoprotegerin, OPG)、细胞核因子κB受体活化因子配体(receptor activator of nuclear factorκB ligand, RANKL)的影响,为进一步阐明地方性氟中毒骨相损害机制的研究提供实验依据。方法一、实验方法1、细胞培养小鼠颅顶骨前成骨细胞亚克隆14(MC3T3-E subclone 14)细胞常规培养于a-MEM培养基(含10%胎牛血清,1×105U／L青、链霉素),5%CO2、37℃条件下培养。2、配制染毒液配制100mM NaF和10mM AlCl3的储备液。在染毒前稀释为工作液,分别为500μM和50μM,为最终染毒剂量的10倍。联合染毒液根据Chabre的方法,以NaF1 mM与AlCl3100 mM 1：1混合,现用现配。3、细胞增殖活力能力检测采用CCK法。实验分组为：对照组、单纯染氟组、单纯染铝组和氟铝联合染毒组。用酶标仪在450 nm处测定各孔的光密度(OD)值。每个剂量组设5个平行样。4、细胞周期检测采用细胞周期试剂盒检测细胞周期的变化。实验分组为：对照组、单纯染氟组、单纯染铝组和氟铝联合染毒组。用FAC Scan流式细胞仪,488 nm处检测红色荧光5、ALP活性测定本实验ALP活性的测定采用ALP test kit。细胞ALP活性的测定根据以下原理：磷酸对硝基苯酚在ALP存在时,能转化为对硝基苯酚和磷酸盐。实验分组为：对照组、单纯染氟组、单纯染铝组和氟铝联合染毒组。6、细胞总RNA的提取采用常规RNA提取法,以Trizol来提取MC3T3-E1细胞中的RNA。实验分组为：对照组、单纯染氟组、单纯染铝组和氟铝联合染毒组。7、引物合成从GenBank下载其cDNA序列,根据文献和专用设计软件Primer 5设计并合成相应的mRNA引物；检索小鼠看家基因(β-actin)、OPG、RANKL、Osterix、Runx2 cDNA序列,由上海生工生物公司设计并合成。8、RT-PCR取细胞总RNA 3μl,检测RNA浓度。用前调整浓度至0.5μg／μl。RT总反应体积为5μl。PCR总反应体积为20μl,具体步骤如下：cDNA 5μl,5×PCR Buffer 5μl,上下游引物(10μM)各0.25μl,Taq酶0.125μl,补水14.375μl,混匀于0.5 mlEP管中。二、统计分析用SPSS 16.0统计软件进行统计分析,组与组之间用两组独立样本t-test;组间比较采用单因素方差分析(ANOVA)。结果1、MC3T3-E1细胞形态观察未贴壁的MC3T3-E1细胞呈圆形,经培养24 h后,在倒置显微镜下可见细胞贴壁生长,细胞呈三角形、纺锤形和多角形等多种形态。形态相似的细胞成堆出现,胞浆伸展,并伸出2-4个突起,细胞核明显,核仁清晰(见图1)。3～4 d,细胞呈指数增长,细胞体积增大,胞浆丰富。6-7 d,细胞融合呈铺石状排列(见图2)。2、氟对MC3T3-E1细胞增殖能力的影响由表1可见,10-9～10-4 M F-作用24～72 h后对MC3T3-E1细胞无促进增殖作用,1 mM F-显著抑制MC3T3-E1细胞增殖(p<0.01)。3、氟、铝及氟铝联合对MC3T3-E1细胞增殖的影响由表2可见,与对照组相比,氟(50μM)或铝(5μM)染毒72 h后对MC3T3-E1细胞无促进增殖作用；氟铝联合染毒(F 50μM+Al5μM)显著促进MC3T3-E1细胞的增殖(p<0.01)。与对照组相比,氟铝联合作用后,增殖率增加了9.2%。4、氟、铝及氟铝联合对MC3T3-E1细胞周期的影响从表3可以看出,与对照组相比,氟(50μM)、铝(5μM)对细胞周期影响不明显；而氟铝联合染毒72 h后,G2／M期细胞显著增多(p<0.05),PI以及DNA相对含量显著增高(p<0.05)5、氟、铝及氟铝联合对MC3T3-E1细胞ALP活性的影响由表4可以看出,对照组相比,氟(50μM)或铝(5μM)矿化液染毒5 d后,MC3T3-E1细胞ALP表达量无明显变化；氟铝联合染毒(F 50μM+Al5μM)显著促进MC3T3-E1细胞的ALP表达(p<0.05),刺激MC3T3-E1细胞分化。6、RT-PCR结果6.1染毒72h氟、铝及氟铝联合对Runx2、Osterix mRNA表达的影响从图7、8可以看出,染毒72 h后,与对照组相比,单纯染氟组(50μM)或单纯染铝组(5μM) Runx2、Osterix mRNA表达无明显变化；氟铝联合染毒组(F50μM+Al5μM)显著促进Runx2 mRNA的表达(p<0.05)；氟铝联合染毒组(F50μM+Al 5μM) Osterix mRNA表达显著增高,有统计学差异(p<0.01)。6.2染毒72h氟、铝及氟铝联合对OPG、RANKL mRNA表达的影响从图10、11、12可以看出,染毒72 h后,与对照组相比,单纯染氟组(50μM)或单纯染铝组(5μM) OPG mRNA的表达无明显变化；氟铝联合染毒组(F 50μM+Al5μM)显著促进OPG mRNA的表达(p<0.05)。各组的RANKL mRNA表达无显著性差异。与对照组相比,氟铝联合染毒组(F 50μM+Al 5μM) RANKL/OPG比值降低,有统计学差异(p<0.05)。结论1、氟铝联合能够显著提高对MC3T3-E1细胞的增殖,并且能显著提高M期细胞的含量,促进成骨细胞由S期向M期转化,促进成骨细胞增殖。2、氟铝联合能增加MC3T3-E1细胞ALP活性,促进成骨细胞分化。3、氟铝联合能够显著提高MC3T3-E1细胞Runx2、Osterix mRNA的表达量,促进成骨细胞形成。氟铝联合能够显著促进OPG mRNA的表达,下调RANKL/OPG比值,使骨重建失衡,从而起到抑制骨吸收、促进骨形成的作用。