论文部分内容阅读
工作目的：DEK是一种在多细胞生物与部分单细胞生物中广泛表达的癌蛋白,在大多数恶性肿瘤中高表达,而在终末分化的细胞中保持低表达水平。DEK可通过改变染色质结构,修复DNA,参与mRNA剪接与信号通路,或作为转录因子等途径调控细胞的增殖、分化、凋亡、迁移、衰老等,与肿瘤细胞的形成有着重要的关系。然而关于DEK在肺肿瘤组织中的表达情况及其作用机理尚未有完善的研究成果。本研究将对肺癌细胞中DEK的表达量、作用、分子机制与转录调控进行检测与探究,深化对DEK与肿瘤形成之间关系的了解。研究方法：本实验通过逆转录PCR (RT-PCR)与免疫组织化学实验(IHC)检测肺癌患者组织中DEK表达水平差异。并通过使用siRNA与DEK过表达载体转染A549肺腺癌细胞,检测DEK沉默与过表达的细胞功能与相关基因表达水平的改变。其中通过MTT法与集落形成法检测DEK表达水平与细胞增殖能力之间的关系,Annexin V-PE细胞凋亡检测试剂盒检测DEK表达水平与细胞凋亡的关系、Matrigel细胞侵袭实验检测DEK表达水平与细胞侵袭能力之间的关系。此外,通过对肺癌患者基因组DNA进行DEK启动子区域的BSP实验,检测其甲基化水平的差异,探究DEK启动子区域甲基化水平与其转录调控的关系。成果和结论：通过RT-PCR实验发现,相对于肺正常组织,DEK mRNA在51.7%的肺肿瘤组织中发生高表达；其中有87.5%的肺腺癌组织发生DEK mRNA的高表达,高于其他组织学类型。而通过IHC实验发现,肺肿瘤组织中,81.5%表现出DEK蛋白的阳性表达,39.5%表现出DEK蛋白的强阳性表达,强阳性率高于正常组织。进一步,通过使用siRNA与DEK过表达载体转染A549肺腺癌细胞系,改变DEK表达量,检测得到肺癌细胞DEK表达水平与细胞增殖能力和侵袭能力有着正相关关系,而与细胞凋亡率有着负相关关系,且p53、p65、ATM三种与DEK功能相关的基因表达量均与DEK的表达水平呈负相关关系。实验同时发现,在肺肿瘤组织中,DEK启动子区域CpG岛的总甲基化水平与E2F和YY1等转录因子结合位点CpG的甲基化水平均有所下降。以上结果显示,DEK在肺癌中的高表达与其作为癌基因的功能密切相关,其作用涉及p53、p65、ATM等DEK相关基因的作用,同时还提示DEK启动子区域去甲基化与其转录活化及肿瘤形成之间的关系。