本课题研究目的是通过检测结核患者外周血中骨桥蛋白(OPN)水平变化以及外周血单个核细胞(PBMC)经卡介苗感染后上清液中OPN水平动态变化，了解骨桥蛋白(OPN)的血浆浓度与结核病的活动性、病情严重程度的关系、疗效评估及预后关系，从而阐明其在结核发病中的作用，为临床结核的诊断及治疗评估提供新的依据。 对象和方法: 1、①．诊断为结核病，并排除心、肝、肾等疾病，无免疫相关性或免疫性疾病的44例结核患者(包括浸润性肺结核8例、粟粒性肺结核3例、空洞型肺结核15例、结核性胸膜炎14例、结核性腹膜炎2例、结核性脑膜炎2例)，男28例，女16例，年龄16～76岁，平均年龄33岁。标本来自中山三院呼吸内科、消化内科及广州市胸科医院，均在抗结核治疗前采血。其中有22例患者经抗结核治疗2月后采血复查检测指标。②．44例结核病人(治疗前)、22例经抗结核治疗后复查病人以及20例正常健康对照组均用一次性注射器抽取清晨空腹静脉血4ml，分为2等份，检测骨桥蛋白的标本使用EDTA Na<,2>抗凝，待检IL-18、IL-4的血标本置于洁净干燥无任何添加物的试管中，常温下静置30min后放入离心机中2000转/min离心20min，分离血清及血浆，置-30℃冰箱中冻存待测。③．外周血单个核细胞(PBMC)的培养上清液采集、培养及处理：以健康志愿者为对象，常规采集外周静脉血20ml分为2份，肝素抗凝，每份加入生理盐水10ml，混匀，注入到含淋巴细胞分层液10ml的离心管内，密度离心法(2000转/min离心20 min)，分层，收集血浆液与淋巴细胞分离液交界的PBMC。沉淀细胞沉渣加入生理盐水10ml洗涤2次。同时沉淀细胞沉渣用RPMI1640培养液重悬细胞，调整细胞数为每孔2X10<6>/ml，注入含10﹪胎牛血清的RPMI1640培养液2ml，混匀，均匀滴入24孔培养板，将BCG调至2X10<6>/ml，加入24孔培养板中，每份分为3孔，测定后取均值。根据预实验并参考文献确定培养时间为3d。放入37℃的5﹪CO<,2>培养箱温育培养72小时(分别于12小时、24小时、36小时、48小时、60小时、72小时)提取培养上清液200μl，提取培养上清液200μl，-30℃冰箱冻存，待测OPN、IL-18、IL-4水平。 2、根据临床症状、体征、胸片、实验室检查结果将44例结核患者分别分为重症结核组(包括粟粒性肺结核和空洞性肺结核)与普通结核组(包括结核性胸膜炎)、痰菌阳性组(包括痰涂片阳性或痰培养阳性)与痰菌阴性组(包括痰涂片阴性或痰培养阴性)、发热组(腋温>37.5℃超过3天，并排除中枢神经疾病、甲状腺功能亢进、皮肤病等疾病)以及无发热组(除去发热组以外的其他病人)、ESR升高组(男性>15mm/h，女性>20mm/h)与ESR正常组(男性≤15mm/h，女性≤20mm/h)，另外，根据世界卫生组织和国际防痨和肺病联合会规定的结核菌素纯蛋白衍化物(purified proteinderivative，PPD)皮试判定结果判定标准：硬结直径≤4mm为阴性(-)，硬结直径5mm～9mm为弱阳性(+)，硬结直径10mm～19mm为阳性(++)，硬结直径≥20mm或虽局部硬结<20mm但出现水泡和淋巴管炎为强阳性反应。将重症结核组与普通结核组、痰菌阳性组与痰菌阴性组、发热组与无发热组、ESR升高组与ESR正常组、PPD皮试≥(++)组与PPD皮试≤(+)组分别进行OPN、IL-18、IL-4检测分析。 3、正常健康对照组20人，男14名，女6名，年龄21～55岁，平均年龄23岁，全部来自本院健康师生志愿者及门诊健康体检者。 4、结核患者、正常健康对照组外周血OPN、IL-18、IL-4及外周血单个核细胞(PBMC)经BCG刺激后提取的培养上清液中OPN、IL-18、IL-4测定用酶联免疫吸附测定法(ELISA)，按试剂盒(OPN产品编号EK0482，IL-4产品编号EK0404，武汉博士德公司分装，广州威佳公司代理)，IL-18(RapidBioLab公司产品，广州威佳公司代理，批号：12150522)，均按说明书要求操作。 5、统计学处理：采用t检验或配对t检验，数据以均数±标准差(x±SD)表示，应用SPSS11.0统计分析软件包进行Independent sample t检验分析。两因素相关分析用直线相关分析。所有数据输入计算机，对治疗前后组血浆OPN水平进行配对样本t检验，余各组外周血中OPN、IL-18、IL-4水平进行独立样本t检验。P<0.05被认为有统计学差异。 结果: 1、结核患者外周血中OPN和IL-18(OPN与IL-18分别为160.54±32.42 ng/ml、180.23±46.92pg/ml)较对照组(OPN与IL-18分别为64.09±21.17ng/ml、86.81±35.62 pg/ml)明显升高。严重肺结核(空洞型、粟粒性肺结核)的IL-4水平(40.06±19.98pg/ml)较普通结核组(27.31±10.55pg/ml)明显升高。 2、经抗结核治疗后患者临床症状均缓解，胸片提示病灶吸收好转或胸腔积液消失，并对22例结核患者进行了抗结核治疗前后OPN与IL-18、IL-4水平对比，治疗后OPN与IL-18水平(OPN与IL-18分别为76.18±20.69ng/ml和98.07±31.56pg/ml)较治疗前(OPN与IL-18分别为152.33±30.19 ng/ml和163.94±38.22pg/ml)明显降低。IL-4水平则是结核发病早期病人中明显低(35.79±13.82pg/ml)，恢复期及治疗后水平上升(63.11±20.96 pg/ml)。 3、结核患者的临床资料：44例结核患者(包括浸润性肺结核8例、粟粒性肺结核3例、空洞型肺结核15例、结核性胸膜炎14例、结核性腹膜炎2例、结核性脑膜炎2例)，男28例，女16例，年龄16～76岁，平均年龄33岁。44例结核患者中，25例发热，空洞性肺结核15例，痰菌阳性15例，胸腔积液14例，PPD皮试≥(++)22例。经抗结核治疗后患者临床症状均缓解，胸片提示病灶吸收好转或胸腔积液消失，并对22例结核患者进行治疗前后OPN、IL-18、IL-4水平对比。 4、①.结核患者中重症结核组(包括粟粒性肺结核和空洞性肺结核)血浆骨桥蛋白水平(173.62±31.19 ng/ml)明显高于普通结核组的血浆骨桥蛋白水平(112.68±26.03 ng/ml)，二者有显著差异(P<0.05)；②.结核患者中痰菌阳性组血浆骨桥蛋白水平(159.35±24.77ng/ml)明显高于痰菌阴性组的血浆骨桥蛋白水平(98.80±30.5lng/ml)，二者有显著差异(P<0.05)；③.结核患者中临床症状有发热组的血浆骨桥蛋白水平(131.18±20.97 ng/ml)与无发热组的血浆骨桥蛋白水平(117.62±25.22ng/ml)二者无显著差异(P>0.05)；④.结核患者中PPD皮试≥(++)组的血浆骨桥蛋白水平(179.38±27.07ng/ml)明显高于PPD皮试≤(+)组血浆骨桥蛋白水平(97.66±23.62 ng/ml)，二者有显著差异(P<0.05)；⑤.结核患者中ESR升高组的血浆骨桥蛋白水平和ESR正常组的血浆骨桥蛋白水平二者无显著差异(P>0.05)。 5、外周血单个核细胞(PBMC)经卡介苗(BCG)刺激后提取培养上清液OPN在48小时达到最高水平(30.69ng/ml)，IL-18在60小时达到最高水平(59.17pg/ml)，IL-4水平则呈逐渐降低趋势。 结论: 1、骨桥蛋白、IL-18、IL-4与结核病发病有明显相关性。结核病患者血浆中骨桥蛋白、IL-18水平明显高于健康对照组，IL-4水平则是结核发病早期病人中明显低，恢复期及治疗后水平上升；治疗前结核患者血浆骨桥蛋白浓度水平与血清IL-18的水平呈正相关性。 2、血浆骨桥蛋白水平和结核病人的临床症状、病情严重程度有密切的相关性，空洞、痰菌阳性组骨桥蛋白水平明显高于无空洞、痰菌阴性组，且治疗好转后结核患者血浆骨桥蛋白水平较治疗前血浆骨桥蛋白水平显著下降。 3、外周血单个核细胞(PBMC)经卡介苗(BCG)刺激后提取培养上清液OPN、IL-18水平呈明显升高趋势，从体外试验提示了OPN、IL-18参与了结核的发病过程。 4、骨桥蛋白可能参与了与结核感染密切相关的细胞免疫(Th1)。外周血OPN水平可以作为判断结核感染、病情变化、结核病情严重程度的指标。