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研究目的:骨髓增生异常综合征(Myelodysplastic Syndrome,MDS)是起源于造血干细胞的一组异质性髓系克隆性疾病,特点是髓系细胞分化及发育异常,表现为无效造血、难治性血细胞减少、造血功能衰竭,高风险向急性髓系白血病(Acute Myeloid Leukemia,AML)转化。MDS是65岁以上成人获得性骨髓衰竭的最常见原因。MDS的发病机制十分复杂,迄今尚不完全明确。MDS往往发生重现性的基因突变,常见的有TET2、DNMT3A、IDH1/2、SF3B1、U2AF1、ASXL1、TP53等。这些突变可能参与MDS发生发展,在MDS中的作用越来越受到重视。肿瘤代谢产物二羟基戊二酸((2R)-2-Hydroxyglutarate,R-2-HG)是异柠檬酸脱氢酶 1 或 2(Isocitrate Dehydrogenasel/2,IDH1/2)突变的产物,是α-KG依赖性双加氧酶的竞争性抑制剂。一直以来,R-2-HG被认为是一种肿瘤代谢物,具有抑制白血病细胞分化,促进肿瘤细胞增殖的特性。然而近期有研究证实,R-2-HG可通过促进细胞周期停滞和细胞凋亡,抑制白血病细胞增殖,发挥抗白血病作用。因此,对R-2-HG的作用机制需要进一步研究。研究方法:(1)用不同浓度(2R)-Octyl-2-HG(100、200、300μmol/L)处理SKM-1,THP-1,Molm-13,HL-60细胞与MDS和AML患者的骨髓单个核细胞,采用MTS法分别检测细胞增殖抑制率。通过慢病毒转染多西环素诱导性表达质粒pLVX-TRE3G-FLAG-IDH2-R140Q-ZsGreenl,使用多西环素来诱导IDH2(R140Q)突变基因的表达,使用MTS法检测细胞增殖抑制率。(2)流式细胞术检测不同浓度(2R)-Octyl-2-HG作用SKM-1,THP-1细胞后的细胞凋亡率和细胞周期。Wstern blot法检测不同浓度(2R)-Octyl-2-HG处理SKM-1,THP-1细胞后的蛋白表达情况。(3)通过 Agilent SurePrint G3 Human Gene Expression v3 芯片,分析(2R)-Octyl-2-HG处理后的SKM-1细胞系的基因转录组表达数据。结合对GEO数据库内经R-2-HG处理的细胞系的基因表达数据,进行基因富集分析。RT-qPCR法和Western blot法检测不同浓度(2R)-Octyl-2-HG处理SKM-1,THP-1 细胞后的mRNA和蛋白表达情况。(4)采用FAN法检测(2R)-Octyl-2-HG处理后细胞死亡方式。免疫共沉淀技术检测RIPK1与caspase8的蛋白质相互作用。利用慢病毒技术,构建RIPK1 shRNA的稳转SKM-1细胞株,利用westernblot和RT-qPCR验证敲低是否成功。使用MTS,FAN法,免疫共沉淀法验证RIPK1敲降后SKM-1细胞系对(2R)-Octyl-2-HG的敏感性。(5)通过尾静脉注射RIPK1 shRNA和scramble shRNA SKM-1细胞至受体小鼠,分析小鼠的生存情况,并通过流式细胞术检测SKM-1细胞在小鼠骨髓内的比例。(6)通过RT-qPCR技术检测86例MDS患者RIPK1基因的表达水平,分析RIPK1基因表达和MDS患者临床特征,危险度分层以及患者生存之间的关系。从公共数据库获得152例MDS患者与17例正常对照中RIPK1基因的mRNA表达水平,分析RIPK1基因的表达差异,基因表达水平与MDS患者临床特征的关系。从公共数据库获得AML患者骨髓标本中,探究患者RIPK1基因的表达情况以及对患者预后的影响。研究结果:(1)R-2-HG抑制高危MDS细胞的增殖活性。(2R)-Octyl-2-HG处理细胞后,SKM-1、THP-1、Molm-13、HL-60细胞系以及MDS和AML患者骨髓原代细胞增殖活性降低,呈剂量依赖性和时间依赖性。慢病毒转染并使用多西环素诱导IDH2 R140Q突变蛋白表达后,SKM-1与THP-1细胞系增殖活性降低,活性抑制率与多西环素剂量相关。(2R)-Octyl-2-HG导致细胞凋亡增加,造成细胞G0/G1期阻滞。(2)R-2-HG导致高危MDS细胞RIPK1表达增加。基因集富集分析结果提示(2R)-Octyl-2-HG处理后RIPK1基因表达增高。进一步证实三种细胞(SKM-1,NOMO-1 和MA9.3ITD)均有RIPK1 基因表达。(2R)-Octyl-2-HG处理SKM-1 和THP-1细胞系,MDS和AML原代细胞后,细胞内RIPK1基因的mRNA和蛋白质表达水平均增高。(3)R-2-HG引发RIPK1依赖性程序性坏死,且早于细胞凋亡发生。(2R)-Octyl-2-HG处理后10小时内,细胞膜通透性被破坏,RIPK1和caspase8蛋白质相互作用增加,磷酸化MLKL增多,而此时caspase酶活性无明显增加,提示程序性坏死早于细胞凋亡发生。RIPK1抑制剂Necrostatin-1与(2R)-Octyl-2-HG共同处理细胞,(2R)-Octyl-2-HG对细胞的增殖抑制作用减轻,细胞膜通透性更稳定,RIPKl-caspase8复合物难以形成。同样的现象出现在RIPK1 shRNA稳定转染的SKM-1细胞中,提示RIPK1依赖性程序性坏死参与(2R)-Octyl-2-HG导致的细胞死亡。(4)体内实验表明,R-2-HG引发的程序性坏死依赖于RIPK1的表达。在RIPK1表达正常的scramble MDS小鼠模型,R-2-HG抑制肿瘤活性,明显减轻小鼠的肿瘤负荷,表现为与对照组相比脾脏重量明显减轻,骨髓CD45+细胞明显减少。在RIPK1表达敲低的MDS小鼠模型,R-2-HG组与对照组相比,小鼠肿瘤脾脏重量和骨髓CD45+细胞比例无统计学差异,小鼠肿瘤负荷无明显改变。说明在体内抑制RIPK1可以降低R-2-HG对MDS恶性克隆细胞的活性抑制作用。(5)低RIPK1表达水平预示MDS患者预后不良,转白率提高。TCGA和GEO公共数据库内MDS和AML患者分析表明,与健康人骨髓细胞相比,MDS和AML患者骨髓细胞RIPK1表达降低。预后生存分析结果显示,RIPK1表达水平较低的患者总生存期(OS)比RIPK1表达水平较高的患者较短。在MDS患者中,RIPK1表达水平较低的患者转白率明显增加。研究结论:本研究证实了 R-2-HG具有抑制MDS和AML细胞活性的作用。R-2-HG引起MDS细胞RIPK1基因表达增强,诱导细胞发生程序性坏死,并且程序性坏死早于细胞凋亡发生。抑制细胞RIPK1的表达或蛋白质功能,可以减轻R-2-HG对MDS细胞和AML细胞的抑制作用。临床研究显示,RIPK1基因的表达低下与MDS和AML患者预后不良有关。并且RIPK1低表达的MDS患者转白率明显增加。