【研究背景及目的】外周神经的损伤及炎症往往导致中枢痛觉过敏，并严重威胁着人类健康和生活质量。然而，现有镇痛药物和治疗手段均不能有效解决，临床上称为神经病理性疼痛。近期研究表明，神经病理性疼痛的发病机制不仅涉及神经损伤，还包括毒性兴奋性刺激以及神经免疫功能失调。除了神经元以外，神经系统的胶质细胞也参与了神经病理性疼痛的形成。这些细胞的激活将介导各种神经递质、细胞因子以及炎症因子的释放。因此，神经元和神经胶质细胞形成了功能调控的网络。而神经病理性疼痛也被科学家看作为神经系统的免疫功能失调。研究发现，调控神经损伤修复和神经发育的Wnt/β-catenin通路也可能介导神经病理性疼痛的发生。Wnt蛋白家族是神经系统的重要分泌蛋白，在神经发育中对细胞增殖与分化起关键作用。Wnt信号通路将直接介导下游分子参与基因转录和分子粘附。 β-catenin又称β连环蛋白，是胞内重要的转录辅助因子。它被认为在肿瘤生长、侵袭，神经系统发育和再生过程中扮演关键角色。β-catenin入核后可以结合T cellfactor/lymphoid enhancer factor （TCF/LEF）启动下游多种蛋白的表达。然而β-catenin在胞内被GSK3β、APC、Axin等分子结合形成降解复合物，从而在胞内浓度相对稳定而不启动入核功能。凡是能影响其降解复合物形成的改变（如阻断GSK3β、APC、Axin功能）都能影响胞浆内β-catenin的浓度和入核功能。文献报道称，β-catenin是影响轴突再生和髓鞘化的关键转录辅助因子。同时也有报道发现肿瘤和免疫细胞内β-catenin可调控炎症及疼痛相关因子的表达，如connexin43, NADPH氧化酶, COX2,MMP-2, TNF-α等。Wnt/β-catenin通路在多种疼痛模型中的表达变化已经被报道，但其表达的变化究竟是一种伴随现象还是介导神经病理性疼痛发生的关键因素尚不明确。另外Wnt/β-catenin通路在外周神经的致痛作用尤其是DRG神经元的作用机制尚待阐明。本研究中，我们检测了四种Wnt蛋白家族的代表分子以及β-catenin在大鼠SNL造模后7天的表达变化。结果发现四种Wnt蛋白Wnt1、Wnt4、 Wnt3a、 Wnt5a的表达在伤侧神经元减少，而β-catenin主要表达卫星胶质细胞，且在伤侧DRG显著降低。卫星胶质细胞由缝隙连接相连,包绕感觉神经元形成细胞环，由此构成了一个感觉神经元的微环境。它可以分泌多种炎症和细胞因子影响神经元的兴奋性。我们进一步通过鞘内缓慢注射Wnt激动剂thiophene pyrimidine derivative有效缓解了SNL大鼠的痛敏症状并增加了卫星胶质细胞β-catenin表达。由此我们推测，Wnt/β-catenin通路在SNL术后DRG表达降低不仅仅是一种伴随现象，它可能通过神经元和卫星胶质细胞之间的交互作用介导神经病理性疼痛。综上所述，鉴于Wnt/β-catenin通路在神经病理性疼痛中的潜在研究价值，本课题通过在体SNL模型和鞘内注射Wnt激动剂研究该激动剂对大鼠机械痛觉及卫星胶质细胞β-catenin表达的影响。并通过体外培养卫星胶质细胞，给予Wnt激动剂以及慢病毒介导β-catenin shRNA影响β-catenin的胞内表达量，检测下游疼痛相关分子iNOS和COX2的表达变化，旨在探索Wnt/β-catenin信号通路在DRG水平介导神经病理性疼痛的作用机制，也期望为开发更有效的止痛药物提供有效靶点，具有理论和临床意义。【研究方法】1.大鼠SNL模型，检测术后机械痛觉阈值和术后DRG Wnt/β-catenin通路表达变化制作SNL造模，并检测术后痛觉阈值变化。取造模成功大鼠术后7天伤侧和健侧DRG，通过real-time PCR检测伤侧和健侧神经组织Wnt1、Wnt3a、Wnt4、Wnt5a的表达变化。通过Western blot技术和免疫组织化学检测Wnt1和β-catenin蛋白在伤侧和健侧神经组织的表达变化，并通过免疫组织化学确定其蛋白的表达定位。2. SNL模型合并鞘内置管术，造模后7天，鞘内缓慢注射Wnt激动剂并检测不同时间点机械痛觉阈值变化和术后DRG中β-catenin的表达变化SNL造模同时行鞘内置管术，在SNL造模成功后第七天痛阈稳定时鞘内缓慢注射Wnt激动剂，同时检测注射药物注射后不同时间点机械痛阈值。分组：1、SNL+Wntagonist（50μM）(n=8);2、SNL+Wnt agonist（10μM）(n=8);3、SNL+Wnt agonist（1μM）(n=8);4、SNL+Veh (n=8);5、Sham+Wnt agonist（50μM）(n=8);6、Sham+Veh(n=8),在注射药物后第8小时处死大鼠，取出给药组和溶剂对照组大鼠伤侧和健侧DRG，通过Western blot技术检测给药组和溶剂对照组β-catenin的蛋白表达变化。通过免疫组织化学检测β-catenin蛋白在给药组和溶剂对照组的表达变化。3.慢病毒介导β-catenin shRNA特异性干预体外培养卫星胶质细胞并检测体外培养卫星胶质细胞，分两组：空病毒组（NC组）和敲减病毒组（KD组），分别在培养基加入空病毒和慢病毒介导β-catenin shRNA3天后，三天后裂解细胞，通过real-time PCR和Western blot技术检测空病毒组（NC组）、敲减病毒组（KD组）β-catenin、iNOS和COX2的表达。4. Wnt激动剂干预体外培养卫星胶质细胞并检测β-catenin和COX2表达体外培养卫星胶质细胞，分三组：对照组、12小时组、24小时组，在培养基加入Wnt agonist（3μM），在不同时间点裂解细胞，通过real-time PCR和Western blot技术检测β-catenin和COX2的表达。5.统计学处理数据使用SPSS13.0统计软件进行分析，结果以X±SED表示。两组间比较采用T检验，多组间比较采用单因素方差分析（one-way ANOVA），行为学数据采用two-way ANOVA:重复测量方差分析和holm-sidak检验， P≤0.05认为差异具有统计学意义。【研究结果】1. SNL术后Wnt在伤侧神经元表达降低SNL造模后7天取伤侧和健侧DRG，通过real-time PCR检测伤侧和健侧神经组织Wnt1、Wnt3a、Wnt4、Wnt5a的基因表达变化。结果发现四种蛋白的基因表达水平伤侧远低于健侧。(SNL/CON, Wnt1:17.2±5.21%; Wnt3a:17.9±5.18%;Wnt5a:16.9±7.91%; Wnt4:57.1±8.94%, each group, n=3,*P＜0.05,**P <0.01)通过Western blot技术和免疫组织化学检测Wnt1蛋白在伤侧和健侧神经组织的表达变化。(SNL vs. CON,Wnt1:0.42±0.04vs.1.12±0.12, n=3,*P＜0.05)免疫组织化学结果发现Wnt1主要表达于NeuN(+)神经元，而Western blot结果提示Wnt1蛋白表达伤侧低于健侧。以上结果具有统计学意义。(SNL：损伤侧，CON：对照侧)2. SNL术后伤侧β-catenin表达在卫星胶质细胞表达降低SNL造模后1、3、7、14天取伤侧和健侧DRG，通过Western blot技术检测伤侧和健测神经组织β-catenin的蛋白表达变化。结果发现伤侧β-catenin的蛋白表达较健侧逐渐降低。(SNL vs. CON,7d:0.18±0.03vs.0.34±0.03;14d:0.14±0.02vs.0.35±0.05, n=4,*P＜0.05)通过免疫组织化学检测β-catenin蛋白在术后14天伤侧和健侧神经组织的表达变化。免疫组织化学结果发现β-catenin主要表达于S100(+)卫星胶质细胞。3.鞘内缓慢注射Wnt激动剂有效缓解了SNL大鼠的痛敏症状并增加了卫星胶质细胞β-catenin的表达SNL造模同时行鞘内置管术，在SNL造模后第七天痛阈稳定时鞘内缓慢注射Wnt激动剂，同时检测注射后不同时间点机械痛阈。结果提示药物注射后4-10小时50μM组较溶剂对照组痛觉阈值提高最明显。(Wnt agonist+SNL vs Veh+SNL,*P＜0.05,**P＜0.01).在注射药物后第8小时处死大鼠，取出给药组和溶剂对照组大鼠伤侧和健侧DRG，通过Western blot技术检给药组和溶剂对照组β-catenin的蛋白表达变化。结果发现对于结扎侧DRG，给Wnt agonist较溶剂对照组有效升高β-catenin的蛋白表达(Wnt agonist vs Veh:0.39±0.04vs.0.24±0.03,n=4,*P＜0.05)。4.慢病毒介导β-catenin shRNA特异性降低体外培养卫星胶质细胞β-catenin表达并增加iNOS和COX2表达卫星胶质细胞培养基加入慢病毒介导β-catenin shRNA3天后，裂解细胞，通过real-time PCR和Western blot技术检测空病毒组（NC组）、敲减病毒组（KD组）β-catenin、iNOS和COX2的表达。结果显示慢病毒介导β-catenin shRNA可有效降低β-catenin表达，基因水平(β-catenin mRNA: KD/NC:28±8%, n=3,*P <0.05)和蛋白水平（KD vs. NC,0.31±0.04vs.0.52±0.04, n=3,*P <0.05)表达均增加。同时，慢病毒介导β-catenin shRNA增加iNOS和COX2的表达。基因水平(COX2mRNA: KD/NC:187±30.7%; iNOS mRNA: KD/NC:1260±136%; n=3,*P <0.05,**P <0.01)和蛋白水平(COX2: KD vs. NC,1.12±0.13vs.0.77±0.1; KD vs. NC,0.32±0.02vs.0.15±0.01, n=3,*P <0.05)表达均增加。5. Wnt激动剂增加体外培养卫星胶质细胞β-catenin表达并减少COX2表达。卫星胶质细胞培养基加入Wnt激动剂的12及24小时后，裂解细胞，通过real-timePCR和Western blot技术检测对照组（CON组）、12小时组和24小时组β-catenin和COX2的表达。结果显示Wnt激动剂在12小时有效增加β-catenin蛋白表达(β-catenin:12h vs CON:1.08±0.09vs0.53±0.03, n=3,**P <0.01)。而Wnt agonist加入12和24小时后，都能减少COX2蛋白水平的表达(12h vs CON:0.53±0.06vs.0.74±0.04;24h vs. CON:0.3±0.04vs.0.74±0.04， n=3,*P <0.05,**P <0.01)，加入Wnt agonist12h组其COX2基因水平的表达也减少(COX2: Wnt agonist/CON:43.6±4.62%, n=3,*P <0.05)。【研究结论】慢病毒介导β-catenin shRNA可降低卫星胶质胞内β-catenin，而β-catenin表达降低可导致疼痛相关分子iNOS和COX2的表达。由Wnt激动剂激活Wnt/β-catenin通路可增加β-catenin同时降低COX2的表达。在大体上SNL模型术后Wnt蛋白在神经元上表达降低，而导致神经元分泌Wnt降低。由此导致了卫星胶质细胞β-catenin的降低。而鞘内缓慢注射Wnt激动剂有效缓解了SNL大鼠的痛敏症状并增加了卫星胶质细胞β-catenin的表达。综上所述，卫星胶质细胞Wnt/β-catenin通路与神经病理性疼痛的发病密切相关。