第一部分cbl C型甲基丙二酸血症患者临床特征目的:分析cbl C型甲基丙二酸血症患者(methylmalonic acidemia,MMA)临床资料,总结归纳cbl C型MMA患者疾病特点,了解cbl C型MMA患者基因突变类型与临床表现相关性,有助于增强临床医生对此病的认识。方法:回顾性分析2009年8月~2019年1月间于我院就诊的566例cbl C型MMA患者临床资料,包括发病年龄、主要临床表现、血串联质谱、尿气相色谱检测结果、头颅MRI检查、基因检测结果及治疗与预后。分析cbl C型MMA患者疾病特点及其基因突变类型与临床表型相关性。结果:566例患者中195例(34.5%)来自新生儿筛查,其中52例(26.7%)发病;371例(65.5%)未筛查患者中30例(8.1%)因同胞确诊检测后诊断本病,未发病,余341例(91.9%)均为临床病例。393例发病患者中,发病患者年龄中位数为3月(1天~26岁),其中早发型患者340例(86.5%)以喂养困难、智力/运动发育落后、嗜睡、抽搐、呕吐多见;迟发型患者53例(13.5%)主要表现为学习成绩下降、记忆减退、表达不畅、运动能力倒退;所有患者均为维生素B12有效型。治疗后患者血中丙酰肉碱、丙酰肉碱与乙酰肉碱比值,尿中甲基丙二酸、甲基枸橼酸水平及血同型半胱氨酸均下降(P<0.05)。脑室扩大、脑外间隙增宽及胼胝体发育不良为常见头颅影像学表现。MMACHC基因检测结果显热点突变为c.609G>A(p.W203X)(32.95%),其次为c.658-660del AAG(p.K220del)(13.07%)、c.80A>G(p.Q27R)(7.69%)、c.567dup T(p.I190Yfs*13)(6.27%)、c.482G>A(p.R161Q)(5.3%)及c.394C>T(p.132X)(3.89%)。携带c.609G>A(p.W203X)、c.658-660del AAG(p.K220del)及c.567dup T(p.I190Yfs*13)突变患者多于1岁内发病,临床表现与早发型MMA相关;携带c.482G>A(p.R161Q)突变患者多于4岁后发病,临床表现与迟发型MMA相关,且治疗后丙酰肉碱、甲基枸橼酸、同型半胱氨酸水平降低显著。随访患者494例,新生儿筛查患者150例(83.3%)发育正常,26例(14.4%)发育落后,4例死亡(2.2%);未筛查患者中91例(29.0%)发育正常,186例(59.2%)发育落后,37例死亡(11.8%)。结论:cbl C型MMA患者多于1岁内发病,以喂养困难、运动\智力障碍、抽搐、嗜睡为最常见临床表现;迟发型较少见,以记忆力/学习成绩下降、认知障碍及运动能力倒退等症状常见。患者脑损伤程度异质性较大,主要表现为脑室扩大、脑外间隙增宽及胼胝体发育不良。MMACHC基因c.609G>A突变为我国热点突变。c.609G>A(p.W203X)、c.658-660del AAG(p.K220del)及c.567dup T(p.I190Yfs*13)与早发型MMA相关;c.482G>A(p.R161Q)与迟发型MMA相关。c.482G>A(p.R161Q)对Vit B12治疗效果优于其他基因突变类型。新生儿筛查有利于cbl C型MMA的早期治疗和远期预后。第二部分cbl C型MMA hi PSCs诱导分化神经元研究目的:建立cbl C型MMA hi PSCs并诱导分化至神经元,为MMA脑损伤机制探索和治疗提供基础。方法:重编程MMACHC基因c.609G>A(p.W203X)纯合突变患者外周血单核细胞建立疾病特异hi PSCs(MMACHC W203X/W203X hi PSCs),碱性磷酸酶染色、RT-PCR、细胞免疫荧光和畸胎瘤形成实验鉴定hi PSCs多能性/胚胎干性,核型分析确定其安全性;CRISPR/Cas9基因编辑技术杂合修复MMACHC W203X/W203X hi PSCs,并进行hi PSCs相关鉴定;EB方案诱导hi PSCs至神经前体细胞及神经元。结果:(1)该hi PSCs携带MMACHC基因c.609G>A纯合突变;碱性磷酸酶染色阳性;表达多能性基因SOX2,REX1,OCT4,NANOG,LIN28;为正常男性核型;具有胚胎干细胞特性。(2)该hi PSCs基因编辑修复后基因型为MMACHC+/W203X;ins T。(3)基因编辑前、后hi PSCs均能诱导为神经前体细胞及神经元,MMACHC W203X/W203X hi PSCs在神经诱导体系中形成拟胚体数量少、结构单一,其分化的神经元MAP2表达水平低于基因编辑修复株及正常对照。结论:成功建立cbl C型MMA疾病特异hi PSCs,即MMACHC W203X/W203X hi PSCs并实现该hi PSCs杂合修复,基因型为MMACHC+/W203X;ins T。MMACHC W203X/W203X hi PSCs神经诱导分化效率低且神经元成熟时间延长。第三部分全身诱导型cbl C型MMA小鼠模型建立目的:建立全身诱导型cbl C型MMA小鼠模型,为探究本病发病机制和治疗新方法提供基础。方法:利用CRISPR/Cas9技术构建Mmachc基因条件性敲除小鼠(Mmachcflox/+小鼠),F1代小鼠与UBC-Cre ERT2小鼠杂交;合笼繁殖选择40~50天龄基因型为Mmachcflox/flox;UBC-Cre ERT2雄性小鼠5只(实验组)及基因型Mmachcflox/+;UBC-Cre ERT2雄性小鼠5只(对照组)分别连续5天腹腔注射Tamoxifen诱导Mmachc基因全身性敲除;记录小鼠体重变化、发病表现;PCR鉴定小鼠各脏器Mmachc基因敲除效率;RT-PCR检测小鼠各器官Mmachc表达变化;串联质谱检测Tamoxifen诱导前、后小鼠尾静脉血C3、C3/C2变化。结果:连续5天腹腔注射Tamoxifen能够诱导Mmachcflox/flox;UBCCre ERT2小鼠Mmachc基因全身性敲除。2只40天龄实验组小鼠发病表现为体重下降、活动减少、呼吸困难,最终死亡;3只50天龄实验组小鼠及对照组均无发病表现;RT-PCR结果显示Tamoxifen诱导后实验组小鼠各器官Mmachc表达下降;串联质谱检测结果显示诱导后实验组小鼠血C3、C3/C2水平升高(P<0.05)。结论:建立全身诱导型cbl C型MMA小鼠模型;Tamoxifen诱导全身诱导型cbl C型MMA小鼠可能存在诱导时间-发病时间相关性。