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炎症是一种针对感染或损伤的适应性免疫反应。适度的炎症反应对机体是有益的,但当发生失调慢性炎症反应时,会引起一系列慢性疾病（癌症,动脉粥样硬化,类风湿关节炎等）。免疫球蛋白G（Ig G）是一种从健康哺乳动物血液中获得的抗体,在脂多糖/植物凝集素诱导的细胞模型系统中表现出显著的抗炎症效果。鸡蛋黄来源卵黄免疫球蛋白（IgY）在结构和Ig G功能上相似,但是IgY比Ig G获取的原材料简单,产量高,具有对哺乳动物抗原有很高的亲和力以及不与类风湿因子反应等特点。其IgY粗提物广泛用于免疫活性和抗炎症活性中。然而IgY的Fc片段不能激活哺乳动物体系相应的免疫调控机制,提高了IgY成为哺乳动物过敏原的风险。目前用来分离纯化Fab和Fc片段方法常常多种色谱柱的联合使用,方法昂贵复杂且费时。因此本论文在研究两种蛋白酶酶解IgY活性片段的基础上,提出了一种高效,绿色环保的Fab片段分离纯化方法,制备高纯度Fab片段。比较Fab片段和IgY结构的差异,进一步阐述Fab片段和IgY在LPS（脂多糖）诱导的RAW264.5炎症模型中的抗炎症功效。研究内容结果如下:第一,本章研究了木瓜蛋白酶和胃蛋白酶分解IgY得到Fab以及Fc片段的酶解条件。当IgY:木瓜蛋白酶质量比为25,半胱氨酸浓度为100 m M,酶解时间为5 h时,IgY的转化率能达到96.8%。通过anti-Fab和anti-Fc免疫印迹分析,表明IgY在木瓜蛋白酶的作用下主要分解成双链的Fab（45 k Da）片段、单链的Fab片段（20 k Da）、双链的Fc片段（60 k Da）以及单链的Fc片段（30 k Da）。当IgY:胃蛋白酶质量比为40,酶解时间为1 h时,IgY能全部水解成Fab片段。经DEAE FF色谱柱处理后,得到纯度97.8%,得率为5.3/100 mg IgY的Fab样品。综上,胃蛋白酶酶解能产生Fab片段,但是纯度与得率更好。而木瓜蛋白酶酶解IgY可得到Fab和Fc两种活性片段,但还需要进一步分离纯化。第二,本研究建立了一种木瓜蛋白酶酶解制备Fab和Fc片段的绿色,高效分离纯化方法。采用45%饱和硫酸铵处理IgY木瓜蛋白酶酶解物,去除位于20k Da附近小分子量肽。随后将含有Fab和Fc片段的混合溶液上样到DEAE-Sepharose离子交换柱上,用10 m M Tris-HCl缓冲液（p H7.6）将Fab片段洗脱出来。然后含有0.21 M Na Cl的10 m MTris-HCl缓冲液（p H7.6）能将与DEAE Sepharose结合的Fc片段洗脱出来。WB和MS分析的结果表明,该方法得到了高纯度Fab和Fc片段。SDS-PAGE分析表明Fab和Fc片段的纯度分别为88.7%和90.1%。第三,IgY及Fab片段的蛋白构象与理化性质研究。CD光谱分析表明经过酶解处理,Fab片段蛋白二级结构的β折叠上升,无规卷曲减少,说明Fab片段结构更加有序。FTIR光谱表明,Fab片段在1396 cm-1和1099 cm-1处糖链振动峰强度增加,表明IgY酶解后,蛋白的相对糖含量增加,Fab片段被包埋的糖链结构暴露。同时,糖链的暴露使得蛋白的疏水性基团向分子内包埋,提高了Fab片段的内源性荧光,降低了紫外吸收强度。因此Fab片段的表面疏水性更低。最后,对Fab片段和IgY的物理性质进行分析,发现Fab片段比IgY具有更低的分子量（44 k Da）,更低的粒径分布（4.152±0.473 nm）,以及更多的表面负电荷。第四,建立LPS诱导的RAW264.7巨噬细胞炎症模型,研究IgY及Fab片段抗炎活性效果。结果表明,LPS刺激炎症模型建立成功后,RAW264.7细胞活性显著升高,IgY和Fab片段对巨噬细胞均没有毒性作用,并且能提高巨噬细胞的活性。研究发现只有Fab片段对LPS诱导的细胞活性的异常增加有显著的抑制作用。50-400μg/m L范围的Fab和IgY都能显著降巨噬细胞TNF-α,IL-6和IL-10因子的表达,且两种不同样品处理没有显著差异,各因子最高能下调69.7%,77.1%和46.1%。同时IgY和Fab片段都能通过NO/i NOS和PGE2/COX-2途径调节炎症反应。且当Fab片段的用量为400μg/m L时,抗炎效果最佳。第五,建立LPS诱导的RAW264.7巨噬细胞炎症模型,研究Fab片段发挥抗炎活性的信号通路。结果表明,在50-400μg/m L浓度范围内,Fab处理能通过NF-κB和MAPK两条信号通路来调节炎症反应。其中400μg/m L的Fab片段作用效果最显著,能将低52.7%的p65核转移,以及42.2%（p38）,41.5%（ERK1）,33.2%（ERK2）,44.2%（JNK1）和39.6%（JNK2）MAPK相关蛋白的磷酸化。Fab片段能够显著抑制TLR4和αVβ3 m RNA的表达量,分别最大下调44.4%和76.1%,表明Fab片段可以同时与巨噬细胞表面的TLR4受体和αVβ3作用,从而抑制激活NF-κB和MAPK两条信号通路。此外通过激光共聚焦分析,表明,αVβ3介导的免疫调节过程,可能涉及到Fab的胞吞介导机制。