【摘 要】
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研究目的:WAVE3在乳腺癌细胞及乳腺正常细胞中的表达量;探讨WAVE3对乳腺癌细胞生物学活性的影响;验证WAVE3对乳腺癌细胞伪足形成的影响。研究方法:利用免疫蛋白印迹（Western blot）法测定乳腺癌细胞（BT-549、HCC-1937、BT-474、MDA-MB-231、MCF-7、T-47D）及乳腺正常细胞（MCF-10A）中WAVE3蛋白的表达情况;利用逆转录-聚合酶链式反应（RT
【基金项目】
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国家自然科学基金（编号:81572616、81772845）； 山东省自然科学基金（编号:ZR2017MH016）；
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研究目的:WAVE3在乳腺癌细胞及乳腺正常细胞中的表达量;探讨WAVE3对乳腺癌细胞生物学活性的影响;验证WAVE3对乳腺癌细胞伪足形成的影响。研究方法:利用免疫蛋白印迹（Western blot）法测定乳腺癌细胞（BT-549、HCC-1937、BT-474、MDA-MB-231、MCF-7、T-47D）及乳腺正常细胞（MCF-10A）中WAVE3蛋白的表达情况;利用逆转录-聚合酶链式反应（RT-PCR）技术从乳腺癌细胞BT-549中扩增WAVE3全长开放阅读框基因,构建WAVE3过表达重组载体SB-16-WAVE3;设计合成靶向WAVE3基因的干扰序列3对,构建靶向WAVE3的重组干扰载体pHB-U6-MCS-PGKPURO-sh WAVE3（pHB-sh WAVE3）。重组干扰质粒在辅助质粒帮助下经人胚肾293FT细胞包装重组慢病毒,病毒液分别感染BT-549和MDA-MB-231细胞,通过嘌呤霉素（Puromycin）抗性筛选建立WAVE3基因静默的稳转细胞株（WAVE3-sh NC、WAVE3-sh RNA-1、WAVE3-sh RNA-2、WAVE3-sh RNA-3）。提取细胞总RNA,RT-q PCR及Western blot法验证WAVE3表达量的变化,筛选WAVE3静默效果最佳的干扰序列;细胞增殖实验探讨WAVE3对乳腺癌细胞增殖的影响;克隆形成实验探讨WAVE3对乳腺癌细胞克隆形成力的影响;Transwell实验检测WAVE3对乳腺癌细胞迁移侵袭的影响;将WAVE3过表达重组载体SB-16-WAVE3经脂质体转染入MDA-MB-231细胞,免疫荧光实验观察WAVE3对细胞伪足的影响。统计方法:采用单因素方差分析,组内比较采用LSD-t检验,两两比较采用t检验。实验结果:1.根据Western blot实验可知,BT-549、HCC-1937、BT-474、MDA-MB-231、MCF-7和T-47D 6种乳腺癌细胞中WAVE3蛋白的相对表达量均高于乳腺正常细胞,t=134.864,21.293,24.880,55.402,8.891,37.366,p值均<0.05,差异有统计学意义。其中MDAMB-231、BT-549的表达量相对更高,蛋白表达量分别是MCF-10A细胞的3.50倍和2.80倍;2.筛选出阴性照及WAVE3稳定干扰的MDA-MB-231稳转细株MDA-MB-231-WAVE3-sh NC、MDA-MB-231-sh WAVE3-1、MDA-MB-231-sh WAVE3-2、MDA-MB-231-sh WAVE3-3,其WAVE3 m RNA的干扰效率分别为79%、64%、42%（MDA-MB-231-sh WAVE3-3的干扰效率较低,舍弃）。阴性对照组WAVE3的蛋白相对表达量分别是静默组-1、-2的2.95倍和2.06倍。3.细胞增殖实验显示WAVE3静默的稳转株pHB-sh WAVE3-1在不同时间点的增值率均低于对照组pHB-sh Negetive Control（pHB-sh NC）组及空白对照组（Control）,t24h=7.98,t48h=9.00,t72h=16.45,t96h=19.91,t120h=39.00;t24h=9.71,t48h=12.84,t72h=15.81,t96h=18.18,t120h=35.27,p值均<0.05。4.pHB-sh WAVE3-1组克隆形成率（25.5±2.00）%比pHB-sh NC组（62.33±2.57）%和Control组（64.17±3.21）%降低,F=204.75。5.迁移实验结果显示pHB-sh WASF3-1组穿过小室的细胞数低于pHB-sh NC组和Control组[（212.33±14.01）个比（357.33±8.02）个和（364.33±9.07）个,F=193.20,p<0.05],后两组间无统计学差异。6.侵袭实验结果显示pHB-sh WASF3-1组穿过小室的细胞数低于pHB-sh NC组和Control组[（151.33±5.51）个比（212.33±14.01）个和（215.00±6.08）个,F=44.27,p均<0.01],后两组间的差异无统计学意义。7.稳定干扰WAVE3的BT-549细胞组进行相同的实验,其结果与MDA-MB-231细胞组的实验结果相一致。8.免疫荧光结果可见:过表达WAVE3后,与对照组相比,WAVE3过表达组的红色信号（WAVE3染色）明显增强,绿染的肌动蛋白（F-actin）在细胞边缘明显聚集,细胞伪足伸展更明显。结论:WAVE3在乳腺癌细胞中高表达。静默WAVE3后乳腺癌细胞的增值、克隆形成及迁移侵袭能力被抑制;过表达WAVE3后可促进乳腺癌细胞F-action蛋白的堆积,促进细胞片状伪足的形成。
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