第一部分犬骨髓间充质干细胞体外分离、培养及鉴定的实验研究目的:探讨出一种可靠、纯度高的犬骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells, BMMSCs)体外提取分离、纯化、培养和鉴定的方法。方法:采用骨髓穿刺、Percoll密度梯度离心法分离出犬骨髓单个核细胞,结合贴壁培养法获得纯度高的骨髓间充质干细胞,应用细胞免疫化学和流式细胞仪对BMMSCs表面标记蛋白进行细胞鉴定和周期测定。结果:分离出的细胞检测显示CD29、CD44均呈阳性表达,CD31、CD34、CD45和vWF的表达为阴性;88.88%的细胞处在G0/G1期;2w内经3代培养即可扩增到107细胞数量级。结论:采用密度为1.073g/ml Percoll分离液梯度离心,并用贴壁纯化的方法可获得纯度较高的BMMSCs。2w内经3代培养即可扩增到107细胞数量级,符合构建组织工程种子细胞的要求。第二部分不同强度超声辐照破坏微泡对犬心肌组织的生物学效应研究目的:探讨不同强度的超声辐照破坏微泡对犬心肌组织的生物学效应。方法: 9只健康成年杂种犬随机分成3组,每组3只。采用频率为1 MHz,强度不同的超声辐照犬心肌组织,辐照时间为5 min,同时静脉输入2 ml(浓度为2×108个/ml)微泡造影剂。辐照完毕后即刻处死动物,取局部心肌组织,进行HE染色和透射电镜观察心肌细胞及毛细血管内皮细胞等细胞超微结构改变。结果: 0.5 W/cm2超声破坏微泡后心肌组织水肿,无出血;1.0 W/cm2超声破坏微泡后心肌组织轻微出血和少量炎症细胞侵润;2.0 W/cm2超破坏微泡后心肌组织明显出血和一定程度的炎症细胞侵润。结论:不同强度超声破坏微泡造影剂能使犬心肌组织产生不同程度的生物学效应,发现超声强度在1.0~2.0 W/cm2时能使心肌损伤程度在不重的情况下引起一定程度的炎症反应。第三部分超声辐照破坏微泡对心肌微环境影响及促犬MSCs归巢缺血心肌实验研究第一节超声辐照破坏微泡对心肌梗死犬心肌微环境的影响研究目的:探讨超声辐照破坏微泡对心肌梗死模型犬局部心肌微环境的影响情况。方法:10只心肌梗死模型犬随机分成两组(实验组与对照组),每组5只。在心肌梗死模型建立1w后,实验组用声强为1.0 W/cm2,频率为1 MHz的脉冲超声经胸辐照左室前壁,辐照10 min,同时静脉输注2 ml(浓度2×108个/ml)微泡造影剂,每2-3 d辐照一次,一共处理3次;对照组不经任何处理。在心肌梗死模型建立14-17 d后处死所有动物,在心肌梗死边缘区取局部心肌组织,通过Western blot、定量实时PCR及免疫组织化学检测血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor VEGF) ,基质细胞衍生因子1(Stromal cell-derived factor-1,SDF-1),血管内皮细胞粘附因子1(vascular cell adhere molecular-1,VCAM-1),白介素1β(Interleukin 1, IL-1β)的表达水平,观察超声辐照破坏微泡对心肌微环境的影响。结果:Western blot和免疫组织化学检查显示实验组心肌分泌VEGF, SDF-1, VCAM-1, IL-1β比对照组多,定量实时PCR检查到实验组内VEGF, SDF-1, VCAM-1, IL-1β表达明显比对照组多(P<0.05)。结论:超声辐照破坏微泡可以引起心肌内源性生物活性物质的分泌,能促进VEGF, SDF-1, VCAM-1和IL-1β分泌,改变了局部心肌微环境。第二节超声辐照破坏微泡促进犬MSCs归巢缺血心肌实验研究目的:观察超声辐照微泡对犬骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells, MSCs)归巢到犬心肌缺血部位的作用。方法:10只心肌梗死模型犬随机分成两组(实验组与对照组),每组5只。在心肌梗死模型建立1w后,实验组用声强为1.0 W/cm2,频率为1 MHz的脉冲超声经胸辐照心肌,辐照10 min,同时静脉输注2 ml(浓度为2×108个/ml)微泡造影剂,每2-3 d处理一次,一共处理3次;对照组不经任何处理。在心梗后2w,实验组经冠状动脉输注5ml(浓度1.35×106个/ml),DAPI标记的MSCs。对照组输注等量的干细胞。移植5 d后处死动物,取心肌梗死边缘区组织,用激光共聚焦显微镜观察MSCs在心肌缺血区的分布情况。结果:通过激光共聚焦显微镜检测到实验组MSCs(66.8±5.03 /HPF),明显比对照组MSCs(14.6±3.76 /HPF)分布多(P<0.05)。结论:超声辐照微泡可明显促进MSCs归巢到心肌缺血部位。