甘蓝型油菜种子代谢物的UPLC-HESI-MS/MS鉴定与重要差异化合物候选基因筛选

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甘蓝型油菜是世界上重要的油料作物,是食用植物油和饲用蛋白重要的来源,具有较高的经济价值。种子作为主要的收获器官,其中含有大量的次生代谢产物,如色素、多酚类物质、木质素和纤维素等,这些物质不仅参与非营养物质的积累、影响种皮色泽变化,还严重影响了菜籽油品质和饼粕饲用价值。在相同遗传背景下相较于黑籽油菜,黄籽油菜具有种皮薄、含油量高、油和饼粕的商品性好等一系列优点,是油菜重要的农艺性状之一。因此,育种家们希望通过选育黄籽油菜的策略来降低皮壳率,减少色素成分含量来进一步提高其品质。然而,在甘蓝型油菜中,色素、多酚类物质及相关酶类是影响粒色变化的重要影响因子,且在芸薹属作物种子中色素与多酚物质主要是山萘酚衍生物、槲皮素衍生物、异鼠李素衍生物和表儿茶素糖苷等四类,但由于其成分的复杂性,且不同植物种子中类黄酮物质的含量还受到基因型及环境条件的影响,因此,对这些组分进行定性与定量分析也就显得极为困难。因此,本研究首先以不同遗传来源的甘蓝型油菜为材料,利用UPLC-HESI-MS/MS方法对其不同发育期种子的代谢组分进行了检测,初步构建了甘蓝型油菜种子代谢库,并对黄黑籽差异组分进行了初步确定;其次,以高世代重组自交系群体为材料,通过UPLC-HESI-MS/MS检测花后30天种子的差异代谢物为考察性状,利用以构建的高密度的遗传连锁图谱对黄黑籽中重要的化合物进行了QTL定位和效应检测分析,最终将紧密连锁标记和关联候选区间mapping到已公布的油菜基因组数据库进行候选区间基因注释,结合转录组数据确定重要的候选基因。其主要结果如下:1初步构建了甘蓝型油菜种子代谢组库本研究利用UPLC-HESI-MS/MS技术,在负离子模式下对黄黑籽甘蓝型油菜不同发育期种子的代谢物进行了检测,最终共检测到1610个质谱峰,基于保留时间(RT)、质荷比(m/z)、二级质谱(MS/MS)、标准样品及相关文献和数据库信息,对上述质谱峰进行了注释,共确定了248种代谢物分成五大类,包括31种酚酸类,54种类黄酮类,24种硫代葡萄糖苷、65种脂质类以及74种其它极性化合物;仅有15.40%(248/1610)被鉴定。2黄、黑籽差异代谢物的初步鉴定利用山萘酚、异鼠李素、槲皮素、表儿茶素4种标样,我们对引起甘蓝型油菜黄黑籽差异的色素和多酚类化合物进行了定性和定量分析,共包括31种酚酸类和54种类黄酮类物质。同时根据其在不同发育期的累积变化特点,我们初步确定了19种可能于黄黑籽差异变化相关的代谢物,主要包括2种酚酸类物质、6种异鼠李素及其衍生物和11种表儿茶素及其衍生物;同时我们对它们在不同黄黑籽35天种子中的含量进行了测定,发现它们在黄黑籽间存在极显著差异,说明它们可能与粒色变化相关联。3黄黑籽甘蓝型油菜重要差异化合物的QTL定位分析本研究以黄籽母本GH06和黑籽父本ZY821构建的高世代重组自交系群体为材料,通过复合区间作图法(CIM)对不同环境下花后30天种子中的类黄酮差异代谢物进行QTL定位分析和效应检测。结果共检测到121个与其相关的QTL位点,分别分布在A01、A02、A03、A04、A05、A06、A07、A08、A09、C01、C02、C04、C05、C06、C07和C08共16条染色体上,单个QTL可解释2.52%-53.31%表型变异,等位位点的贡献作用既有来自母本,也有来自父本。尽管不同环境检测出的QTL位点不同,但也有同一连锁标记在不同环境和不同化合物中被重复检测到,且在A09、C04染色体上检测出的QTL位点较多并集中分布,其中位于A09染色体上的大部分QTL解释表型变异大于10%,被认为是主效QTL。4候选基因的筛选以公布的甘蓝型油菜“Darmor-bzh”基因组为参考,利用紧密连锁SNP标记将关联候选区间mapping到参考基因组对应的位置,再根据参考基因组的基因信息对其进行注释分析。结果在16条染色体的对应QTL区间内共注释并初步筛选出317个可能与其相关的候选基因;同时,结合黄黑籽甘蓝型油菜不同发育期转录组分析的结果共初步鉴定了19个与其相关的差异候选基因。这些候选基因可能是参与甘蓝型油菜种子色素代谢变化的重要候选基因,其相关功能需要进一步验证。综上所述,本研究初步建立了甘蓝型油菜种子代谢组数据库,并完成了黄黑籽中差异代谢物的重要候选基因初步鉴定,对进一步揭示甘蓝型油菜粒色变化的分子遗传调控机理和利用基因工程进行油菜品质遗传改良和新种质资源的开发具有重要指导意义。
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