随着人口老龄化的增加,脑血管疾病在我国发病率越来越高。脑组织对缺血敏感性较高,一旦发生缺血,会迅速出现病理改变,很快进入不可逆损伤状态,而血流恢复后又容易引发一系列复杂级联反应,出现神经细胞凋亡、坏死以及延迟性的神经功能障碍,即为缺血再灌注损伤(I/RI)。氧自由基大量释放、钙超载、NO过度释放、兴奋性氨基酸、炎症因子释放均可参与脑缺血再灌注的损伤。缺血再灌注损伤后容易引起远期神经系统功能障碍,学习、记忆和认知都会受到影响。临床上短暂性脑缺血再灌注损伤,一般发生在急救措施之后,如心肺复苏术,心脏骤停和休克患者的抢救后,神经外科手术围术期以及体外循环后也易出现。胆碱能抗炎通路(Cholinergic anti-inflammatory pathway,CAP)是一条神经免疫调节通路,它的激活可有效减少促炎因子的释放,具有明显的炎症抑制作用。它是一种内源性神经反馈调节机制:当中枢神经系统受到免疫刺激后,投射到迷走神经核团,激活中枢迷走神经,使外周神经末梢释放乙酰胆碱,与网状内皮细胞上的α7亚单位的N型乙酰胆碱受体(nicotinic acetylcholine receptorsα7,α7nAChR)特异性结合,通过细胞内的信号传导通路,参与众多生物学过程,如增殖、分化、黏附、迁移和凋亡等。细胞凋亡是细胞的一种程序性死亡,主要包括信号转导、基因调控和凋亡效应的执行三个阶段,而信号转导过程的激活则是细胞凋亡的启动者。p38MAPK/NF-κB是细胞内重要的信号转导通路,在细胞的增殖及凋亡过程中发挥着重要作用。丝裂原激活的蛋白激酶(mitogen activated protein kinases,MAPKs)为丝氨酸-苏氨酸蛋白激酶,参与细胞生长、增殖、分化、凋亡等多种生理过程。p38MAPK主要介导炎症反应、创伤以及应激等信号传递,在调节炎症反应、神经退行性改变和神经细胞凋亡过程中发挥作用,p38通路过度激活能够抑制细胞生长甚至凋亡。右美托咪定(Dex)是临床常用的一种镇静药物,同时也有镇痛和抗焦虑的作用,主要作用于α2受体。近年来研究证实:右美托咪定可激活丝裂素活化蛋白激酶(MAPK)来防御大鼠蛛网膜下腔出血诱导的脑损伤,抑制促炎因子的释放以及减少钙超载;预防缺血再灌注损伤引起的心肌、肝、肠,肺、肾脏以及脑损伤。同时还可抑制线粒体凋亡,氧糖剥夺,钙超载,来保持线粒体的功能稳定。以上研究显示右美托咪定具有抗凋亡、抗炎、脑保护作用,但是右美托咪定使用剂量差别很大且既往没有进行比较。据此,我们提出假设,右美托咪定对于脑缺血再灌注损伤具有保护作用,且保护作用呈剂量相关性。右美托咪定能够抑制交感神经,间接兴奋副交感神经,减慢心率,和迷走神经作用类似,本文拟从胆碱能抗炎通路方面探讨右美托咪定的脑保护作用。本研究包括以下两个方面:1、右美托咪定对减轻脑缺血再灌注损伤,抑制海马神经元细胞的凋亡是否有剂量相关性。2、探讨胆碱能抗炎通路是否参与右美托咪定的脑保护作用。第一部分:不同剂量右美托咪定对缺血再灌注损伤大鼠海马神经元细胞的作用目的:本研究通过建立大鼠大脑中动脉闭塞模型(MCAO),采用不同剂量右美托咪定进行干预,观察不同剂量右美托咪定对缺血再灌注大鼠海马神经元细胞的影响。方法:40只大鼠随机分为5组,每组8只,分别为假手术组(S)、缺血再灌注组(I/R)、Dex高剂量组(DH)、Dex中剂量组(DM)、Dex低剂量组(DL)。S组只对大鼠进行血管分离,不进行插线栓;I/R组和Dex组采用右侧大脑中动脉闭塞2h后再灌注24h建立脑缺血再灌注动物模型,I/R组不进行药物干预,Dex高剂量组(DH,60μg/kg)、Dex中剂量组(DM,6μg/kg)、Dex低剂量组(DL,0.6μg/kg)在缺血前给予不同剂量的Dex进行干预。用2,5,3,5-三苯基四氯化钴(TTC)染色检测神经损伤,采用湿-干加权法和HPLC-质谱仪分别检测脑组织中水和γ-氨基丁酸的含量,TUNEL染色和流式细胞术检测海马神经元凋亡。此外,通过实时定量PCR和Western blot检测酶切caspase-3、Bcl-2和Bax的mRNA和蛋白表达。结果:1.不同剂量右美托咪定对I/R大鼠神经功能评分的影响与假手术组相比,I/R组大鼠神经功能评分明显降低;与I/R组相比,DM、DH组大鼠神经功能评分明显升高;与DM组相比,DL组大鼠神经功能评分明显降低,DH组大鼠神经功能评分明显升高;差异具有统计学意义(P<0.05)。2.不同剂量右美托咪定对I/R大鼠脑梗死面积和含水量的影响与假手术组相比,I/R组大鼠脑梗死面积及含水量明显增加;与I/R组相比,DM、DH组大鼠脑梗死面积和含水量明显减少;与DM组相比,DL组大鼠脑梗死面积及含水量明显增加,DH组大鼠脑梗死面积及含水量明显减少;差异具有统计学意义(P<0.05)。3.不同剂量右美托咪定对I/R大鼠脑组织γ-氨基丁酸含量的影响与假手术组相比,I/R组大鼠海马组织Y-氨基丁酸含量明显降低;与I/R组相比,DM、DH组大鼠海马组织γ-氨基丁酸含量明显升高;与DM组相比,DL组大鼠海马组织γ-氨基丁酸含量明显降低,DH组大鼠海马组织γ-氨基丁酸含量明显升高;差异具有统计学意义(P<0.05)。4.不同剂量右美托咪定对I/R大鼠海马神经细胞凋亡的影响与假手术组相比,I/R组大鼠海马神经细胞凋亡明显增多;与I/R组相比,DM、DH组大鼠海马神经细胞凋亡明显减少;与DM组相比,DL组大鼠海马神经细胞凋亡明显增多,DH组大鼠海马神经凋亡明显减少;差异具有统计学意义(P<0.05)。5.不同剂量右美托咪定对I/R大鼠海马组织Caspase-3蛋白的影响与假手术组相比,I/R组大鼠海马组织caspase-3蛋白水平显著升高;与I/R组相比,DM、DH组大鼠海马组织caspase-3蛋白水平显著降低;与DM组相比,DL组大鼠海马组织caspase-3蛋白水平显著升高,DH组大鼠海马组织caspase-3蛋白水平显著降低;差异具有统计学意义(P<0.05)。6.不同剂量右美托咪定对I/R大鼠海马组织Bcl-2/Bax mRNA含量和蛋白表达水平的影响与假手术组相比,I/R组大鼠海马组织Bcl-2/Bax mRNA含量和蛋白水平显著降低;与I/R组相比,DM、DH组大鼠海马组织Bcl-2/Bax mRNA含量和蛋白水平显著升高;与DM组相比,DL组大鼠海马组织Bcl-2/Bax mRNA含量和蛋白水平显著降低,DH组大鼠海马组织Bcl-2/Bax mRNA含量蛋白水平显著升高;差异具有统计学意义(P<0.05)。结论:1.右美托咪定能够减轻I/R大鼠神经功能损伤,减少脑梗死面积。2.右美托咪定可以上调Bcl-2/Bax蛋白表达,对I/R大鼠海马神经元细胞具有明显保护作用;3.右美托咪定的脑保护作用具有剂量依赖性,随剂量增加,保护作用增强。第二部分:胆碱能抗炎通路介导右美托咪定对缺血再灌注大鼠海马神经细胞的保护机制目的:1.探讨右美托咪定对I/R大鼠海马神经细胞的保护作用是否与迷走神经有关。2.阐明胆碱能抗炎通路是否介导右美托咪定对I/R大鼠海马神经元细胞的保护作用。实验一:方法:40只大鼠随机分为5组,每组8只,分别为假手术组(S组)、缺血再灌注组(I/R组)、右美托咪定组(Dex组)、Dex+迷走神经切断组(D+V组)和迷走神经切断组(V组)。所有大鼠均进行模型建立干预,S组大鼠不插入线栓,正常缝合;I/R组大鼠缺血2小时后去除线栓;Dex组在制备MCAO前静脉输注剂量为Dex(6ug/kg),D+V组给与Dex(6ug/kg)前切断迷走神经,迷走神经切断组在制备模型前切断迷走神经。所有大鼠均在灌注24h后处死,测定各组大鼠神经功能评分、脑组织含水量及梗死面积,检测炎性因子TNF-α、IL-6和IL-1β水平,测定海马神经细胞凋亡率和NF-κBp65、Bcl-2、Bax、Caspase-3、CytC及p-p38的蛋白表达。结果:1.迷走神经切断对I/R大鼠含水量、脑梗死面积及神经功能评分影响与假手术组相比,I/R组大鼠脑组织含水量、脑梗死面积及神经功能评分均显著增加;与I/R组相比,右美托咪定组大鼠脑组织含水量、脑梗死面积及神经功能评分均显著降低;与右美托咪定组相比,D+V组脑组织含水量、脑梗死面积及神经功能评分均显著提高,差异具有统计学意义(P<0.05)。2.迷走神经切断对I/R大鼠脑组织中TNF-α、IL-1β和IL-6水平的影响与假手术组相比,I/R组大鼠脑组织匀浆中TNF-α、IL-6和IL-1β水平显著增加;与I/R组相比,右美托咪定组大鼠脑组织匀浆中TNF-α、IL-6和IL-1β水平显著减少;与右美托咪定组相比,D+V组大鼠脑组织匀浆中TNF-α、IL-6和IL-1β水平显著提高,差异具有统计学意义(P<0.05)。3.迷走神经切断对I/R大鼠海马神经元细胞凋亡率的影响与假手术组相比,I/R组海马细胞凋亡率明显升高;与I/R组相比,右美托咪定组凋亡率明显降低;与右美托咪定组相比,D+V组凋亡率明显升高,差异具有统计学意义(P<0.05)。4.迷走神经切断对I/R大鼠海马细胞凋亡蛋白表达水平的影响与假手术组相比,I/R组海马组织中Bax、Caspase-3的蛋白表达显著升高,Bcl-2蛋白表达显著降低;与I/R组相比,右美托咪定组海马组织中Bax、Caspase-3的蛋白表达显著降低,Bcl-2蛋白表达显著升高;与右美托咪定组相比,D+V组海马组织中Bax、Caspase-3的蛋白表达显著升高,Bcl-2蛋白表达显著降低,差异具有统计学意义(P<0.05)。5.迷走神经切断对I/R大鼠p-p38、CytC和p65蛋白表达水平的影响与假手术组相比,I/R组p-p38、CytC和p65蛋白表达明显升高;与I/R组相比,右美托咪定组p-p38、CytC和p65蛋白表达明显降低;与右美托咪定组相比,D+V组p-p38、CytC和p65蛋白表达明显升高,差异具有统计学意义(P<0.05)。实验二:方法:40只大鼠随机分为5组,每组8只,分别为假手术组(S组)、缺血再灌注组(I/R组)、右美托咪定组(Dex组)、Dex+α-银环蛇毒素组(D+G组)和α-银环蛇毒素组(G组)。所有大鼠均进行模型建立干预,S组大鼠不插入线栓,正常缝合;I/R组大鼠缺血2小时后去除线栓;Dex组在制备MCAO前静脉输注剂量为 Dex(6ug/kg),D+G 组给与 Dex(6ug/kg)前给 α-GBT(1ug/kg),G 组在制备模型前给与α-GBT(1ug/kg)。所有大鼠均在灌注24h之后处死,测定各组大鼠的神经功能评分、脑组织含水量以及脑梗死面积,检测炎性因子TNF-α、IL-6 和 IL-1β 水平,测定脑细胞凋亡率和 NF-κBp65、Bcl-2、Bax、Caspase-3、p-p38及CytC的蛋白表达。结果:1.α7nAChR抑制剂对I/R大鼠含水量、脑梗死面积及神经功能评分影响与假手术组相比,I/R组大鼠脑组织含水量、脑梗死面积及神经功能评分均显著增加;与I/R组相比,右美托咪定组大鼠脑组织含水量、脑梗死面积及神经功能评分均显著降低;与右美托咪定组相比,D+G组大鼠脑组织含水量、脑梗死面积及神经功能评分均显著提高;差异具有统计学意义(P<0.05)。2.α7nAChR抑制剂对I/R大鼠脑组织中TNF-α、IL-1β和IL-6水平的影响与假手术组相比,I/R组大鼠脑组织匀浆中TNF-α、IL-6和IL-1β水平显著增加;与I/R组相比,右美托咪定组大鼠脑组织匀浆中TNF-α、IL-6和IL-1β水平显著减少;与右美托咪定组相比,D+G组大鼠脑组织匀浆中TNF-α、IL-6和IL-1β水平显著提高;差异具有统计学意义(P<0.05)。3.α7nAChR抑制剂对I/R大鼠海马神经元细胞凋亡率的影响与假手术组相比,I/R组大鼠海马神经元细胞凋亡率明显升高;与I/R组相比,右美托咪定组凋亡率明显降低;与右美托咪定组相比,D+G组凋亡率明显升高;差异具有统计学意义(P<0.05)。4.α7nAChR抑制剂对I/R大鼠海马细胞凋亡蛋白表达水平的影响与假手术组相比,I/R组大鼠海马组织中Bax、Caspase-3的蛋白表达显著升高,Bcl-2蛋白表达显著降低;与I/R组相比,右美托咪定组海马组织中Bax、Caspase-3的蛋白表达显著降低,Bcl-2蛋白表达显著升高;与右美托咪定组相比,D+G组海马组织中Bax、Caspase-3的蛋白表达显著升高,Bcl-2蛋白表达显著降低;差异具有统计学意义(P<0.05)。5.α7nAChR抑制剂对I/R大鼠p-p38、CytC和p65蛋白表达水平的影响与假手术组相比,I/R组p-p38、CytC和p65蛋白表达显著升高;与I/R组相比,右美托咪定组p-p38、CytC和p65蛋白表达显著降低;与右美托咪定组相比,D+G组p-p38、CytC和p65蛋白表达显著升高;差异具有统计学意义(P<0.05)。结论:1.右美托咪定发挥脑保护作用依赖迷走神经的完整性。2.胆碱能抗炎通路介导了右美托咪定对脑缺血再灌注损伤的保护作用。3.右美托咪定脑保护作用的实现可能与p38MAPK受体介导的凋亡有关。