[研究背景]恶性肿瘤是严重威胁人类健康的疾病,肿瘤发病机制、影响肿瘤进程相关因素和肿瘤治疗方法研究一直是生物医学领域的重点。乳腺癌是女性中常见的恶性肿瘤之一,也是女性癌症死亡的主要原因之一,得益于早期诊断技术和治疗手段的不断改进,乳腺癌患者的病死率逐渐降低,但是仍有大量患者进展至远处器官转移,而转移是乳腺癌致死的主要原因。乳腺癌是一种遗传和表型异质性疾病,乳腺癌肿瘤微环境中含有乳腺癌细胞和大量浸润免疫细胞,研究肿瘤微环境中浸润免疫细胞与乳腺癌之间的相互作用,以及对肿瘤进程的影响,寻找新的乳腺癌治疗靶点,对于乳腺癌的基础研究和临床治疗都有重要意义。巨噬细胞作为机体内重要的免疫细胞,除了在炎症的发生及恢复时发挥重要功能,其在肿瘤免疫微环境中也起到了重要作用。研究表明,巨噬细胞可刺激肿瘤血管生成,增强肿瘤细胞侵袭能力,对抗NK细胞和T细胞对肿瘤细胞的杀伤作用,促进肿瘤转移,降低化疗药物治疗效果。因此,巨噬细胞清除术可能成为一种有效的免疫治疗新方法。CD169+巨噬细胞是巨噬细胞的一种亚型,在清除入侵机体的病原微生物、支持骨髓造血、维持骨结构等生理功能中具有重要作用。CD169+巨噬细胞对肿瘤发生发展的影响,目前研究存在争议,而乳腺癌微环境中CD169+巨噬细胞的功能以及相关机制,尚缺乏研究。因此系统研究CD169+巨噬细胞对乳腺癌进程的影响,可以使我们更好的理解CD169+巨噬细胞对乳腺癌发展的影响机制,拓宽我们对CD169+巨噬细胞相关肿瘤免疫疗法的认识,为肿瘤免疫微环境调控机理提供新的理论依据,为乳腺癌治疗提供新靶点。[研究目的]通过清除荷瘤小鼠中的CD169+巨噬细胞,研究CD169+巨噬细胞在动物模型中对乳腺癌原位生长和转移的影响,阐述其通过抑制CD8+T细胞促进肿瘤进展的机制,探究CD169+巨噬细胞清除后对于乳腺癌动物模型引起的副肿瘤综合征的影响。[研究方法]1.将C57BL/6背景的CD169-DTR鼠连续与BALB/c小鼠杂交,每一代挑选CD169-DTR阳性小鼠,连续杂交11代后,进行子代CD169-DTR杂合子小鼠杂交,获得BALB/c背景的CD169-DTR纯合子小鼠。2.采用BALB/c背景的CD169-DTR转基因小鼠,乳腺原位接种4T1细胞构建小鼠三阴性乳腺癌模型,接种肿瘤细胞1周后,开始测量肿瘤大小,同时开始连续给予实验组白喉毒素,以清除CD169+巨噬细胞,测量肿瘤大小至接种后28天,处死小鼠,收集肿瘤组织、外周血、股骨、脾脏和胸腺,计算肿瘤体积,电子天平称量肿瘤重量。3.采用BALB/c背景的CD169-DTR转基因小鼠,乳腺原位接种4T07细胞构建小鼠三阴性乳腺癌模型,接种肿瘤细胞10天后,开始测量肿瘤大小,同时开始连续给予实验组白喉毒素,以清除CD169+巨噬细胞,测量肿瘤大小至接种后28天,处死小鼠,收集肿瘤组织、外周血和脾脏,计算肿瘤体积,电子天平称量肿瘤重量。4.给予BALB/c背景的CD169-DTR转基因小鼠腹腔注射淀粉,3天后用无血清培养基冲洗腹腔,获得腹腔来源巨噬细胞,进行体外培养48小时后,给予白喉毒素,观察巨噬细胞死亡情况。5.将各组小鼠外周血取出后,采用红细胞裂解液裂解红细胞,取外周血中有核细胞,采用FITC Rat Anti-Mouse CD3和APC Rat Anti-Mouse CD8 双参数标记外周血中的CD8+T细胞,流式细胞仪分析外周血中的CD8+T细胞比例。6.将各组小鼠脾脏取出后,通过研磨制成单细胞悬液,采用FITC Rat Anti-Mouse CD3和APC Rat Anti-Mouse CD8双参数标记脾脏单细胞悬液中的CD8+T细胞,流式细胞仪分析脾中的CD8+T细胞比例。7.采用IV型胶原酶和DNA酶消化肿瘤组织,制成肿瘤组织单细胞悬液后,采用FITC Rat Anti-Mouse CD3和APC Rat Anti-Mouse CD8双参数标记肿瘤组织单细胞悬液中的CD8+T细胞,流式细胞仪分析肿瘤组织中的CD8+T细胞比例。8.将4T1荷瘤小鼠胸腺取出,拍照并称量各组小鼠胸腺重量。9.将小鼠脾脏取出后,拍照称重,采用脾应力检测仪检测各组小鼠脾脏的极限应力。10.将小鼠脾脏取出后,甲醛固定,石蜡包埋切片后,HE染色,观察记录各组小鼠脾包膜厚度及脾内小梁数。11.取各组小鼠股骨后,清除股骨表面软组织,100摄氏度烘干48小时至恒重,电子天平测量小鼠股骨骨干重的差异。12.将小鼠股骨烘干至恒重后,采用双能X光双能骨密度检测仪测定各组小鼠股骨骨密度,记录各组小鼠骨密度变化。13.将小鼠股骨骨髓冲出骨髓腔,制成单细胞悬液,稀释后显微镜下采用血球计数板计数,计算骨髓中细胞总数。14.取骨髓单细胞悬液,采用APC Rat Anti-Mouse Ter1 19和PE Rat Anti-Mouse CD71双参数标记骨髓中未成熟红细胞,采用APC Rat Anti-Mouse Ter1 19和Thiazole orange双参数标记骨髓中原红细胞、幼红细胞和网织红细胞,流式细胞仪分析骨髓中红细胞生成状况。15.将原代培养巨噬细胞与4T1肿瘤细胞共培养后,APC Rat Anti-Mouse CD169和PE Rat Anti-Mouse PD-L1标记巨噬细胞,流式细胞仪检测CD169+巨噬细胞表面PD-L1的表达水平。16.将原代培养巨噬细胞与4T1肿瘤细胞置于细胞爬片上共培养后,将细胞固定打孔,APC Rat Anti-Mouse CD169、PE Rat Anti-Mouse PD-L1 和DAPI染色细胞,激光共聚焦分析CD169+巨噬细胞和4T1细胞表面PD-L1的表达水平。17.通过尾静脉注射4T1乳腺癌细胞,构建4T1肺转移模型,将4T1转移模型小鼠肺脏取出后,Bouin氏染液固定后拍照,计算各组小鼠肺部结节数。18.通过尾静脉注射4T1乳腺癌细胞,构建4T1肺转移模型,将4T1转移模型小鼠肺脏取出后,用甲醛固定,石蜡包埋切片,HE染色后显微镜下计数肺部转移灶的数量。19.通过尾静脉注射4T1乳腺癌细胞,构建4T1肺转移模型,将4T1转移模型小鼠外周血、脾脏及肺部肿瘤结节取出后,制成单细胞悬液,FITC Rat Anti-Mouse CD3和APC Rat Anti-Mouse CD8双参数标记CD8+T细胞,流式细胞术检测各组小鼠体内CD8+T细胞比例。20.使用Western Blot检测肿瘤组织中的Cyclin-D1、MCL-1、BCL-XL、E-cadherin和Vimentin的表达水平变化,以及ERK1/2的磷酸化水平变化。[研究结果]1.经过11代连续杂交鉴定,最终获得BALB/c背景的CD169-DTR纯合子小鼠。2.在4T1三阴性乳腺癌模型中,CD169-DTR转基因荷瘤小鼠组给予白喉毒素后,相较于野生型荷瘤小鼠组、野生型荷瘤小鼠给予白喉毒素组以及CD169-DTR转基因荷瘤小鼠给予0.9%生理盐水组,肿瘤生长速度明显减慢,实验终点时肿瘤重量明显减轻。实验结果提示,在4T1小鼠三阴性乳腺癌模型中,清除CD169+巨噬细胞后,4T1肿瘤生长受到明显抑制。3.在4T07乳腺癌模型中,清除CD169+巨噬细胞后,肿瘤生长速度明显减慢,实验终点时肿瘤重量明显减轻。实验结果提示,在4T07乳腺癌模型中,CD169+巨噬细胞能够促进4T07肿瘤的生长。4.体外培养BALB/c背景CD169-DTR转基因鼠的腹腔源性巨噬细胞给予白喉毒素后,能够发现CD169-DTR转基因小鼠来源的腹腔巨噬细胞在给予白喉毒素后,在光学显微镜下出现明显的变圆,透光度增加等细胞死亡的现象,而野生型小鼠来源的腹腔巨噬细胞在给予相同浓度的白喉毒素后,未出现细胞死亡的现象,说明BALB/c背景的CD169-DTR小鼠依然能够与C57BL/6背景的CD169-DTR小鼠类似,给予白喉毒素后可以高效清除CD169+巨噬细胞。5.在4T1和4T07小鼠乳腺癌模型中,CD169-DTR转基因荷瘤小鼠组给予白喉毒素后,相较于野生型荷瘤小鼠组、野生型荷瘤小鼠给予白喉毒素组以及CD169-DTR转基因荷瘤小鼠给予0.9%生理盐水组,外周血、脾脏和肿瘤组织中的CD8+T细胞比例明显升高,说明在清除CD169+巨噬细胞后,荷瘤小鼠机体的肿瘤免疫逃逸受到抑制,CD8+T细胞明显增多,从而起到抑制肿瘤生长的作用。6.在4T1三阴性乳腺癌模型中,荷瘤小鼠胸腺相较于对照组明显缩小,清除CD169+巨噬细胞后,荷瘤小鼠的胸腺大小和重量明显增加。7.在4T1和4T07小鼠乳腺癌模型中,荷瘤小鼠存在明显的脾肿大副肿瘤综合征,脾脏所能承受的极限应力明显缩小,清除CD169+巨噬细胞后,荷瘤小鼠的脾肿大明显受到抑制,脾脏所能承受的极限应力显著增加。8.在4T1三阴性乳腺癌模型中,荷瘤小鼠脾脏包膜厚度明显变薄,脾脏内脾小梁数明显减少,清除CD169+巨噬细胞后,荷瘤小鼠的脾包膜厚度显著增厚,脾脏内大于30um的脾小梁数显著增加。9.在4T1和4T07小鼠乳腺癌模型中,小鼠股骨干重明显减轻,股骨密度明显降低,表明4T1和4T07小鼠乳腺癌模型存在严重的骨质破坏,荷瘤小鼠发生骨折风险明显提高,清除CD169+巨噬细胞后,荷瘤小鼠股骨干重和骨密度未见明显改变。10.在4T1小鼠乳腺癌模型中,小鼠股骨明显变白,骨髓内细胞总数明显降低,表明4T1小鼠乳腺癌模型存在严重的骨髓造血系统破坏,清除CD169+巨噬细胞后,荷瘤小鼠股骨颜色和骨髓内细胞总数未见名明显改变。1I.流式细胞术分析表明,体外培养的腹腔来源CD169+巨噬细胞高表达PD-L1,在与4T1肿瘤细胞共培养后,CD169+巨噬细胞PD-L1的表达量进一步升高。12.激光共聚焦成像显示,体外培养的腹腔来源CD169+巨噬细胞高表达PD-L1,与4T1肿瘤细胞共培养结果显示,CD169+巨噬细胞表面PD-L1的表达量升高,且CD169+巨噬细胞表面PD-L1表达水平明显高于4T1肿瘤细胞。13.在4T1三阴性乳腺癌肺转移模型中,清除CD169+巨噬细胞后,Bouin氏染液染色后发现肺部转移结节总数明显减少,肺石蜡切片HE染色后,病理观察发现肺部转移灶明显减少,说明在4T1三阴性乳腺癌肺转移模型中,清除CD169+巨噬细胞能够明显抑制4T1三阴性乳腺癌的转移。14.在4T1三阴性乳腺癌肺转移模型中,清除CD169+巨噬细胞后,外周血、脾脏及肺部肿瘤结节中CD8+T细胞比例相较于其它荷瘤小鼠组明显升高,说明清除CD169+巨噬细胞后,荷瘤小鼠体内抗肿瘤免疫增强,进而抑制肿瘤转移。15.在4T1肿瘤组织中,清除CD169+巨噬细胞后,Cyclin-D1、MCL-1、BCL-XL和Vimentin的表达水平明显降低,ERK1/2的磷酸化水平明显下降,E-cadherin的表达量明显升高,说明在清除CD169+巨噬细胞后,能够使得肿瘤组织中的细胞周期蛋白减少,抗凋亡蛋白水平降低,从而抑制肿瘤细胞的增殖能力,促进肿瘤细胞的凋亡,肿瘤细胞内的信号转导通路受到抑制,抑制肿瘤细胞的活力,同时EMT信号通路激活受到抑制,肿瘤的转移潜能降低。[结论]CD169+巨噬细胞在乳腺癌小鼠模型中通过高表达PD-L1抑制CD8+T细胞,从而发挥免疫抑制作用,进而促进肿瘤进展,清除CD169+巨噬细胞能够增加CD8+T细胞在乳腺癌小鼠模型内的数量,抑制肿瘤的生长和转移等恶性行为,同时对肿瘤引起的相关副肿瘤综合征有一定的抑制作用。