GBV-C/HGV是美国Abbott实验室Simons及Genelabs实验室Linnen等人分别于1995年、1996年独立克隆的新型致病因子，分别称为GBV-C及HGV。由于核酸和蛋白水平的高度同源性，二者被认为是同一种病毒，本文统称为HGV。HGV是单正链RNA病毒，长约9400nt，编码2900左右氨基酸，含一个开读框架，基因组5’端结构基因依次编码核心蛋白、包膜蛋白1和包膜蛋白2；3’端非结构基因依次编码非结构蛋白NS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A和NS5B，在5’及3’端侧翼分别为5’及3’非编码区，因此HGV被认为与HCV一样，属黄病毒科成员。本实验室于1998年也成功克隆了HGV的全长cDNA，命名为HGVqz（GenBank登录号为AF081782）。 HGV的进一步研究受阻于无合适的HGV研究体系，其宿主范围窄，只感染人和黑猩猩等高等灵长类动物，因此建立转基因小鼠使常规的实验动物“感染”HGV，并对其进行确切的研究是本文主要解决的问题。转基因动物已成为研究新型病毒的一种工具，尤其对于宿主范围很窄的病毒。本文即以HGV的全长cDNA HGVqz为材料，以转基因小鼠为实验体系研究HGV的基本生物学性质，对HGV的复制、蛋白表达及剪切、致病性、嗜肝性等问题进行初步探讨。一、次全长HGV转基因小鼠HGVcns3TGM的建立及研究 将包含HGV全部结构基因及部分非结构基因的表达载体pHGVns3转染至Chang liver细胞中进行体外表达，得到了143KD的表达产物，随后用限制性内切酶SalI及XmnI酶切质粒得到5.6Kb目的片段，以此片段为外源基因，利用显微注射法产生了次全长HGV转基因小鼠，基因组DNA PCR及Southern blotting证明，该小鼠外源基因可稳定传递，各组织RT-PCR结果表明HGV基因可以在肝细胞及淋巴细胞内转录，免疫组化结果显示，蛋白表达主要位于肝细胞。常规病理学切片观察，某些转基因小鼠有轻度的肝细胞损伤。这些结果显示：转基因小鼠在体内不存在免疫反应的情况下，HGV的蛋白产物在肝细胞的表达可能会引起肝细胞损伤。但由于此小鼠所表达的仅仅是HGV部分基因，有必要对HGV全长基因在转基因小鼠体内的状况作进一步探讨。二、全长HGV转基因小鼠HGVFTGM的建立及研究 HGVqz全长基因为9373bp，共编码2874个氨基酸，编码区位置从第442位核苷酸开始至9063位为止。起始位点的氨基酸为MGPP，与其它HGV全长基因的起始氨基酸序列（MAVL）有较大差异，但据分析它仍具有保守的剪切位点。 第二军医大学博上论文 摘要 利用此克隆构建由不同启动子调控的HGV表达载体，将两种表达载体及 HGV全长基因转染至Chang liver及NIH 3T3细胞中进行体外表达，结果发现 HGVqZ可以在体外表达分子量约 31 OKD的 HGV前体蛋白，但不能完成前体蛋 白的剪切。随后以HGV全长基因为目的片段，用显微注射方法产生了整合HGV 全长基因的F。［IlldCf ’J’鼠。遗传分析发现，FI及FZ代转基因小鼠阳性率分别为 71％、76％，外源基因在转基因小鼠体内可以稳定遗传且随机整合。 转基因小鼠各组织 RT－PCR检测表明：HGV RNA可以在多个组织检测到， 而且单核细胞、肝、肾、肺等若干组织还有复制中间体负链RNA的存在，HGV RNA也可分泌至血清中。 转基因小鼠若干组织的免疫组化实验表明：HGV基因可以在转基因小鼠肝。 肾、肺等多个组织内表达，各个组织的表达强度不一致，以肝脏表达最强，但 HGV抗原在肝小叶中的分布并不均匀，以中央静脉周围最多。血清ELISA结果 表明 HGV抗原还可以分泌到血清中。肝、肾、肺、脾等组织的Western blotting 实验结果表明：HGV蛋白前体在转基因小鼠体内被剪切成若干大小不同的片 段，杂交所得到的片段应为含EZ蛋白的剪切中间体。实验结果表明体内外的实 验体系明显存在差异，转基因小鼠体系更有利于HGV生物学特性研究。 为进一步检验 HGV转基因小鼠是否具有传染性，用 HGV RNA阳性的转基 因小鼠血清感染M。It斗细胞，发现M。It－4细胞可以支持HGV短期复制，细胞 上清的Western七lotting实验表明：HGV病毒蛋白从感染的第9天开始出现，直 至第 19天。细胞上清中 RNA与病毒蛋白出现的一致性提示：细胞上清中可能 具有HGV的病毒颗粒。此转基因小鼠极象HGV自然感染的宿主，可将HGV分 泌至血清中并具传染性。 常规病理学切片观察显示：转基因小鼠基本不发生明显的病理学变化，只有 肝脏组织有轻微的肝细胞浊肿，其他组织均未见异常。血清酶学分析显示，转基 因小鼠与正常小鼠血清转氨酶水平无明显差异，极个别有转氨酶升高现象。血清 ELISA实验证明转基因小鼠体内不存在HGV的抗体，电子显微镜观察显示转基