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肠外致病性大肠杆菌(Extraintestinal Pathogenic E.coli,Ex PEC),是一类新的致病性大肠杆菌菌群,定植于宿主肠道外其它组织,主要导致肠道外的感染。该菌可穿越人和动物肠屏障及血脑屏障,在临床上能够引起新生儿脑膜炎和尿路感染;犊牛的腹泻、脑膜炎和败血症等,临床发病率与病死率都较高。Ex PEC能引起中枢系统疾病,多因素参与其致病过程,尤其是侵袭素Ibe家族蛋白Ibe A、Ibe B、Ibe C等毒力因子在致新生儿脑膜炎大肠杆菌K1株黏附、侵袭宿主细胞中扮演重要角色。前期本实验室从神经症状的犊牛脑组织中分离到血清型为O161型的E.coli-SN株,侵袭素Ibe家族蛋白在E.coli-SN株是否存在,与致新生儿脑膜炎大肠杆菌K1株有什么样的关系,是否参与E.coli-SN株的致病性,目前尚不清楚。本研究以临床犊牛脑炎分离株E.coli-SN为研究对象,采用PCR方法检测ibe B基因,通过Red/ET同源重组系统构建ibe B基因缺失突变株E.coli-SN-Δibe B,比较亲本株与突变株之间在体外生物学特性和小鼠致病性的差异,为Ex PEC致病机制奠定基础。主要研究内容和结果如下:1.致犊牛脑炎大肠杆菌分离株ibe B基因的序列分析:为了分析致犊牛脑膜炎大肠杆菌分离株ibe B基因的序列。采用PCR方法,从分菌株克隆ibe B基因,连接到p MD19-T构成p MD19-T-ibe B,经测序、拼接、比对后获得ibe B基因全长序列,并采用DNAStar软件分析分菌株ibe B基因序列。试验结果表明:E.coli-SN株与标准株大肠杆菌K1 RS218核苷酸和氨基酸同源性分别90.5%和96.9%,进化树聚为一支;E.coli-SG株与大肠杆菌K12的核苷酸和氨基酸同源性分别为99.4%和100.0%,进化树聚为一支。初步揭示致犊牛脑膜炎大肠杆菌分离株E.coli-SN与致新生儿脑膜炎大肠杆菌K1株ibe B基因密切相关,亲缘性更近。2.E.coli-SN ibe B基因缺失株的构建及鉴定:为深入研究ibe B基因在E.coli-SN致病力中的作用,本研究应用Red/ET同源重组技术对目的基因ibe B进行了敲除。根据目的基因ibe B的上下游序列和FRT-PGK-gb2-kan/neo-FRT序列设计一对引物用于同源重组缺失株的构建。第一步将质粒p Red ET电转化入E.coli-SN的感受态细胞中,30℃培养;L-阿拉伯糖诱导质粒p Red ET的表达。第二步电转化,将FPF-ibe B同源臂片段电转化入E.coli-SN-p Red ET感受态细胞中。第三步将707-FLPe质粒电转化入E.coli-SN-Δibe B-FPF感受态细胞中,37℃诱导表达,将标记性基因丢失,所有重组菌株均采用相应PCR验证鉴定。37℃、无抗性压力条件下传代培养20代,PCR检测无返祖现象,表明突变菌株具有良好的遗传稳定性。即成功构建E.coli-SN基因缺失株E.coli-SN-Δibe B。3.E.coli-SN-Δibe B基因缺失株部分生物学特性的研究:为了明确E.coli-SN ibe B基因的功能,本试验进行了缺失突变株的溶血试验,体外耐酸耐碱培养试验,毒力检测及对小鼠肝、脑、脾载菌量的测定。结果显示:突变株的溶血特性、体外耐酸耐碱并未发生改变;与亲本株E.coli-SN相比较,E.coli-SN-?ibe B突变株对小鼠LD50高出101.16倍,但差异不显著;接种突变株E.coli-SN-?ibe B在小鼠肝组织载菌量均显著降低(t=24h,p<0.01;t=48h,p<0.05),在脾脏组织的载菌量也均显著降低(t=24h,p<0.05;t=48h,p<0.01),但在脑组织中的载菌量减少但不显著;感染E.coli-SN-?ibe B缺失株小鼠存活时间(平均3.38天)比E.coli-SN亲本株(平均2.25天)显著延长(p<0.05)。结果表明ibe B毒力基因的缺失可减弱E.coli-SN菌株的毒力。