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牙周炎是目前成年人失牙的主要原因之一,牙周炎治疗的最终目的是希望获得牙周支持组织,包括牙槽骨、牙周韧带和牙骨质从结构和功能上的再生与重建。为了达到该目的,常需在骨缺损区放置生物植骨材料。近几年,人工合成的生物材料用于骨缺损的修复已受到越来越多的关注。已有大量研究显示纳米羟基磷灰石/壳聚糖复合体(NanoHydroxyapatite/Chitosan,nHA/CS)具有良好的生物相容性、骨引导性、可注射性等,更有许多学者已将其作为药物载体载入中药、蛋白药物、抗生素等,实现药物的缓释作用。口腔作为一个有菌环境,在植入骨修复材料的初期需控制细菌,避免创口感染,在远期需防止因牙周炎复发引起的骨吸收。在这样的情况下,传统的全身使用抗生素不仅效果差,而且可以导致多种副作用和体内药物毒性的累积。因此,本实验将nHA/CS作为药物载体,载入临床治疗牙周炎的常用药物盐酸米诺环素,从而构建了载米诺环素的纳米羟基磷灰石/壳聚糖复合体(Minocycline-Nano Hydroxyapatite/Chitosan,M-nHA/CS)。该nHA/CS及M-nHA/CS通过化学反应发泡制孔,可在需要充填时由医生将粉液调和,根据骨缺损形状进行充填,避免了传统骨充填材料因预制成型而使其无法与宿主骨密切贴合等缺点。该实验对新构建的M-nHA/CS的理化性能、药物释放、抑菌性以及生物相容性进行了全面的评价,为其应用于临床骨缺损的修复提供实验依据。第一部分载米诺环素纳米羟基磷灰石/壳聚糖复合体的理化性能研究目的:通过对载药前后的nHA/CS进行孔隙率、扫描电镜、固化时间、抗压强度以及pH值等理化性能方面的检测。旨在观察米诺环素对nHA/CS理化性能方面造成的影响。方法:使用共沉淀法分别制备nHA/CS及M-nHA/CS两组复合材料。使用维卡仪测量两组复合材料的初凝时间以及终凝时间;万能材料试验机测量两组复合体的抗压强度;阿基米德原理测量复合体的孔隙率;扫描电镜观察两组复合材料的孔径大小、孔隙分布情况;pH计测量两组复合体1周内浸提液的酸碱度。结果:M-nHA/CS的初凝时间和终凝时间均有延长,两组数据经统计学分析有显著性差异(P<0.05)。抗压强度有明显下降的趋势,nHA/CS抗压强度为37.65MPa,M-nHA/CS抗压强度仅为21.7 MPa,两组数据经统计学分析有显著性差异(P<0.05)。M-nHA/CS与nHA/CS材料内部呈多孔结构,孔的形状多样,尺寸不等,贯通性较好。nha/cs组平均孔隙率为43.68%、m-nha/cs组为53.99%,m-nha/cs与nha/cs相比孔隙数目增多,且两组数据经统计学分析有显著性差异(p<0.05)。m-nha/cs孔径较nha/cs增大,约20-200μm不等。两组材料ph值至第4天均达到7.3后趋于稳定,整个实验过程中ph均处于6.9-7.4的中性范围,没有表现出比较强的酸碱性,两组材料每日的ph值经统计学分析无显著性差异(p>0.05)。结论:1.米诺环素的载入延长了nha/cs的固化时间。2.米诺环素的载入了降低了nha/cs的抗压强度。3.米诺环素的载入使得nha/cs的孔径增大,孔隙率增高。4.米诺环素载入前后nha/cs的ph值未发生明显改变,未表现强酸或强碱性。第二部分载米诺环素纳米羟基磷灰石/壳聚糖复合体的体外释放及抑菌性研究目的:观察该复合物所载药物的体外释放情况以及对牙龈卟啉单胞菌和金黄色葡萄球菌的抑制作用。方法:将m-nha/cs及nha/cs分别浸泡在人工唾液内,使用高效液相色谱法测量每日人工唾液内米诺环素的释放量。抑菌环法测量两组复合材料对牙龈卟啉单孢菌和金黄色葡萄球菌的体外抑菌作用。结果:米诺环素的单日释放量在第2天达到峰值,为3.77μg,之后逐日减少,1周后达到稳态,长期维持在0.5-1μg/d。至第14天仍可检测到0.83μg/d的释放量。m-nha/cs以初期骨溶蚀后期扩散的形式进行药物释放,该释放在前4天最符合higuchi模型。之后的第5-14天其释放较符合零级释放及一级释放。1周后,m-nha/cs周围仍可观察到对金葡萄球菌20mm的抑菌圈,牙龈卟啉单胞菌24mm的抑菌圈,对两种细菌均表现出良好的抑制作用。结论:1、本实验合成的m-nha/cs其释放在前4天最符合higuchi模型。第5-14天较符合零级释放及一级释放。该载药复合物是以初期骨溶蚀后期扩散的形式进行药物释放。2、通过高效液相色谱法及抑菌圈测量的结果显示m-nha/cs可长期缓慢释放有效抑菌浓度的米诺环素。第三部分载米诺环素纳米羟基磷灰石/壳聚糖复合体的生物相容性检测目的:观察牙周膜干细胞在m-nha/cs及nha/cs表面及浸提液中的生长增殖情况及其浸提液培养诱导牙周膜干细胞的分化成骨情况。方法:用组织块法进行牙周膜干细胞的原代培养,制备m-nha/cs及nha/cs浸提液,用cck-8试剂盒测量牙周膜干细胞在两组浸提液中的增殖情况,酶标仪测量各组od值。将牙周膜干细胞接种在m-nha/cs及nha/cs的表面,15天后固定、脱水、临界点干燥、喷金、扫描电镜观察。pcr实时定量法分别对m-nha/cs及nha/cs浸提液中培养的牙周膜干细胞进行ALP、COL-1、OCN、OPN、OPG成骨标志物的检测。结果:两组复合材料组的OD值在培养第3天时均高于空白对照组,而其中M-nHA/CS的OD值为最高。两组复合体浸提液中分别培养牙周膜干细胞72h后,其OD值分别与空白组相比,经统计学分析有显著性差异(P<0.05)。相对于空白对照组,nHA/CS的相对增殖率在前2天为98%,细胞毒性等级为1级,至第3天上升至100%以上,细胞毒性等级为零级。M-nHA/CS组3天内的相对增殖率均大于100%,细胞毒性等级为零级。扫描电镜结果显示M-nHA/CS与nHA/CS的相比,其表面爬行细胞更多、更密,细胞在材料表面彼此重叠,相互遮盖。PCR检测结果显示ALP的表达水平M-nHA/CS较nHA/CS稍低,两组数据经统计学分析有显著性差异(P>0.05)。与nHA/CS相比,各成骨相关基因(COL-1、OCN、OPN、OPG)的表达水平M-nHA/CS较高,两组数据经统计学分析有显著性差异(P<0.05)。可认为与nHA/CS相比,M-nHA/CS可促进PDLSCs向成骨方向分化。结论:1.本实验合成的M-nHA/CS与nHA/CS均具有良好的生物相容性。2.该M-nHA/CS可以更好的促进牙周膜干细胞在其表面爬行生长,对牙周膜干细胞的增殖及分化成骨起到了促进作用。