百合观赏性强、商业价值高,是在国际领域占有重要地位的球根花卉,但其种球繁殖和种质创新还存在许多问题需要解决。体细胞胚发生具有繁殖系数高、变异率低等诸多优点,是有望解决上述问题的有效途径,但百合体胚发生的分子机制尚不明确。本课题组前期研究表明miR166a在百合体胚发生过程中差异表达,但其靶基因LpLMBR1的功能在植物中尚未见报道。为探索lpu-miR166a及其靶基因LpLMBR1在百合体胚发生及形态建成中的功能,本研究克隆了细叶百合(Lilium pumilum DC.Fisch)miR166a初级体(lpu-pri-miR166a)及其靶基因LpLMBR1完整CDS区域,并进行了生物信息学分析。借助于课题组建立的百合稳定高效遗传转化体系,通过基因过表达、敲除及沉默等技术,初步明确了 miR166a在百合体细胞胚发生及形态建成中的作用,首次在植物中探讨了LpLMBRl的功能。主要研究结果如下:1.克隆得到LpLMBRl完整CDS序列;LpLMBRl编码蛋白为疏水性蛋白,位于胞外,是膜的固有组成成分,起着细胞连接的作用;LpLMBR1在细叶百合的叶片、根和鳞片中特异性表达,其中叶片中的表达量最高,根中最低。在胚性愈伤保存阶段和子叶形胚时期LpLMBR1表达量显著高于诱导15 d时的表达量,初步判断该基因在胚性细胞形成以及体细胞胚发生后期具有重要的调控作用。2.成功构建了 lpu-pre-miR166a和LpLMBR1的过表达和敲除载体,以及miR166a的沉默载体。利用农杆菌介导的遗传转化体系,对二者在铁炮百合‘White Heaven’中均进行了敲除与过表达,同时完成了LpLMBR1在细叶百合中的敲除。通过对转基因植株进行体胚诱导效率鉴定发现:细叶百合LpLMBR1敲除植株鳞片颜色较绿、体胚诱导初期褐化严重,体胚诱导能力显著降低,颜色为暗黄色且畸形胚数量增多,同时‘子叶形胚’在诱导42 d左右出现,形成时间较早,表明LpLMBR1对于百合体胚维持正常形态至关重要。3.组织形态学观察结果表明,过表达miR166a后,‘White Heaven’植株不定芽和不定根萌发系数升高、根系生长速度显著加快;LpLMBR1过表达株系则表现出叶片卷曲,不定芽萌发能力较弱,侧根数目减少,在不定芽再生过程中出现子叶融合等现象。结合定量结果可知:LpLMBR1不利于百合叶片和根系的形态建成且miR166a与其呈负调控关系。但LpLMBR1过表达株系鳞茎生长速度较对照植株快,植株矮小粗壮,其对鳞茎发育的调控作用有待于进一步探索。