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苹果果实酸度和色泽是两个非常重要的品质性状,直接影响苹果的商品价值。 苹果酸是苹果果实中最主要的有机酸,在成熟果实中占有机酸总量的80%以上,直接决定果实的酸度,对果实的风味影响巨大。在苹果果实中,高浓度的苹果酸通过主动运输在果肉细胞的液泡中储存,该过程需要液泡型质子泵和苹果酸转运蛋白的驱动。其中,两种液泡型ATPase: V-ATPase和V-PPase可以在液泡内外建立跨膜的电化学势梯度,使液泡酸化,并为次级转运蛋白(如苹果转运蛋白)提供能量。 苹果果实的色泽形成是花青苷在果皮中积累的结果,花青苷通过类黄酮代谢途径合成,在液泡中储存。而果肉细胞液泡中的pH可以影响花青苷的显色。 目前,已经陆续鉴定了多个调控果肉细胞液泡pH和果皮色泽的因子,但果实色泽和酸度信号途径的交叉作用及信号转导网络的关键节点,还不清楚。 本研究鉴定了苹果MdCIPK18和MdMYB1/10调控果实酸度和色泽的分子机制,初步构建了果实酸度和色泽形成的调控网络。主要结果如下: 1、过量表达苹果V-ATPaseB亚基基因MdVHA-B1提高转基因材料的苹果酸含量 系统进化树分析了苹果V-ATPase的各亚基基因;将V-ATPase B亚基基因MdVHA-B1遗传转化苹果愈伤和番茄,结果表明,MdVHA-B1过量表达明显提高了转基因材料中的苹果酸含量。 2、盐胁迫诱导MdVHA-B1基因的表达促进苹果酸积累 在盐胁迫处理下,野生型和MdVHA-B1过量表达苹果愈伤中的苹果酸积累水平提高,但MdVHA-B1基因抑制表达的苹果愈伤中的苹果酸含量变化不明显,表明盐胁迫诱导MdVHA-B1基因的表达促进苹果酸的积累。 3、盐响应蛋白激酶MdCIPK18上调MdVHA-B1基因表达促进苹果酸积累 在盐胁迫下,MdCIPK18和MdVHA-B1的表达模式类似。遗传分析表明,MdCIPK18作用于MdVHA-B1上游,促进其基因表达和蛋白的积累。随后,遗传转化苹果愈伤组织,证明MdCIPK18上调MdVHA-B1基因表达促进苹果酸的积累。 4、MdCIPK18磷酸化MdVHA-B1蛋白负调控V-ATPase活性 酵母双杂交、免疫共沉淀和Pull-Down结果表明,MdCIPK18与MdVHA-B1蛋白相互作用。另外,盐胁迫诱导MdVHA-B1蛋白396位置处的Ser残基发生磷酸化。一系列的离体和活体试验表明,MdCIPK18催化了该位点的磷酸化修饰,促进了苹果酸积累。 5、MdMYB1/10结合MdVHA-B1启动子促进花青苷和苹果酸的积累 ChIP-PCR和EMSA结果表明,MdMYB1/10蛋白直接结合MdVHA-B1基因启动子的MYB顺式作用元件。转基因试验和GUS活性分析表明,MdMYB1转录激活MdVHA-B1基因的表达,增强V-ATPase活性,促进花青苷和苹果酸在液泡中的储存,提高苹果果实的色泽和酸度。