目的:慢性炎症反应释放氧化介质和各种细胞因子，在恶性肿瘤发生中起重要作用。本实验室前期研究发现长期灌胃黄曲霉毒素G1(AFG1)诱导的慢性炎症反应在肺腺癌发生中起重要作用。慢性炎症反应可以造成肿瘤来源的靶细胞Ⅱ型肺泡上皮细胞(AT-Ⅱ)氧化应激损伤和增殖，在这个过程中我们发现炎症细胞因子TNF-α和IL-6在炎症肺组织中高表达。IL-6是目前发现的具有癌基因功能的炎症细胞因子，但在AFG1诱导的炎症微环境中，IL-6是否加剧AFG1致AT-Ⅱ细胞损伤作用还不清楚。　　为了揭示在AFG1诱导的炎症微环境中IL-6对AT-Ⅱ细胞氧化应激损伤的影响，本研究体外培养具有人AT-Ⅱ细胞特征的A549细胞，给予IL-6和AFG1共同作用，模拟IL-6和AFG1协同作用的慢性炎症微环境。探讨AFG1和IL-6联合作用对AFG1活化相关酶细胞色素P450(Cyp450)活性，以及A549细胞损伤的影响。　　方法:　　1、细胞培养与处理　　具有人AT-Ⅱ细胞特征的A549细胞培养于含10％胎牛血清、100 U/ml青霉素、100 U/ml链霉素的RPMI-1640培养基中，37℃、5％ CO2培养，细胞贴壁生长。　　选择对数生长期的细胞（传代后24 h）随机分为溶剂对照组和实验组。实验组给予AFG1（4μg/ml）单独处理和AFG1（4μg/ml）与IL-6(20μg/ml)联合处理，溶剂对照组给予终浓度为0.08％的DMSO（每组设平行样本3个），继续培养24 h收集细胞进行相关指标检测。　　2、流式细胞术(FCM)　　采用流式细胞术(FCM)分别检测AFG1单独处理和AFG1与IL-6联合处理对A549细胞中活性氧生成的影响。　　3、免疫组织化学(IHC)染色　　按照我研究组前期灌胃AFG1诱导NIH小鼠肺腺癌的动物造模方法，经口给予Balb/c小鼠灌胃AFG16个月（每周3次），停止灌胃AFG1。选择AFG1灌胃6个月的小鼠慢性炎症肺组织标本，检测肺泡上皮细胞中与毒素代谢相关活化酶细胞色素P450亚型，Cyp1A2、Cyp2A6和Cyp2A13的表达情况。　　4、蛋白免疫印记（Western blot）　　采用蛋白免疫印记(Western blot)方法分别检测AFG1单独处理和AFG1与IL-6联合处理对A549细胞的影响，检测氧化应激损伤相关蛋白SOD2、γH2AX、ATM和ATR的表达;检测细胞色素酶P450亚型，Cyp1A2、Cyp2A6和Cyp2A13的表达情况;检测STAT3信号通路的激活，包括stat3和p-Stat3的蛋白表达;检测与增殖和凋亡相关蛋白BCL-XL、CyclinD1、Bax等的表达情况。　　5、Real-time PCR　　采用Real-time PCR方法分别检测AFG1单独处理和AFG1与IL-6联合处理对炎症细胞因子分泌及A549细胞中Cyp450酶活性的影响，包括IL-1β、IL-6、IL-10、IL-12、TNF-α、Cyp1A2、Cyp2A6、Cyp2A13和Cyp3A4。　　6、MTT　　采用MTT法检测AFG1单独处理和AFG1与IL-6联合作用对于A549细胞存活率的影响。　　7、阻断剂处理　　对数生长期A549细胞，分别给予1μM Cpd188（STAT3的阻断剂）预处理30min。实验分为4组，即溶剂对照组、AFG1与IL-6联合处理组、阻断剂组、和阻断剂+AFG1+IL-6处理组。细胞处理24 h后收集细胞检测相关指标。　　8、siRNA转染　　用100 pmol STAT3特异性siRNA转染细胞，再加入AFG1+ IL-6继续培养24 h收集细胞进行相关指标检测。同时转染Negative control siRNA(NC siRNA)作为阴性对照。检测STAT3基因被干扰后，蛋白的表达情况，包括Stat3、p-Stat3、Cyp1A2、Cyp2A6、Cyp2A13和γH2AX。　　9统计学分析　　应用SPSS Statistics17.0软件，计量资料以均数±标准差（(x)±s）表示，P＜0.05时认为差异有统计学意义。　　结果:　　1、AFG1和IL-6联合处理对A549细胞氧化应激反应和DNA损伤的影响　　FCM和Western Blot实验结果表明，与AFG1单独处理组相比，IL-6和AFG1联合处理可以更早的引起A549细胞中ROS生成增多（P＜0.05）;AFG1单独处理对SOD-2表达没有影响，而IL-6和AFG1联合处理明显促进γH2AX和SOD-2的表达(P＜0.05);DNA损伤的感应分子ATM和ATR在联合处理组也明显高于AFG1单独处理组(P＜0.05)。说明IL-6与AFG1联合处理可以加速A549细胞中ROS生成，IL-6促进AFG1诱导的氧化应激损伤。　　2、IL-6和AFG1联合处理对A549细胞中细胞因子表达的影响　　Real-time PCR检测结果表明，与对照组相比，AFG1单独作用可以增加A549细胞中TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-10、IL-12和MIP-2的mRNA水平表达(P＜0.05);IL-6与AFG1联合作用，进一步上调IL-1、IL-6、IL-10、IL-12的mRNA表达水平(P＜0.05)。提示IL-6与AFG1发挥协同作用，促进AT-Ⅱ细胞分泌炎症细胞因子。　　3、灌胃AFG1肺部组织中Cyp450酶的表达情况　　选择AFG1灌胃6个月的小鼠慢性炎症肺组织标本，检测肺泡上皮细胞中与毒素代谢相关活化酶细胞色素P450亚型，Cyp1A2、Cyp2A6和Cyp2A13的表达情况。IHC染色结果显示，Cyp1A2、Cyp2A6和Cyp2A13的表达水平较对照组明显升高(P＜0.05)。　　4、IL-6和AFG1联合处理对A549细胞中Cyp450酶的影响　　体外给予IL-6和AFG1联合作用A549细胞后，Real-time PCR检测结果显示，AFG1和IL-6联合作用，明显上调Cyp1A2、Cyp2A6和Cyp2A13在mRNA水平的表达(P＜0.05);而AFG1单独作用对Cyp2A6和Cyp2A13的表达没有影响。Western Blot检测结果显示，AFG1和IL-6联合作用明显上调Cyp1A2、Cyp2A6、Cyp2A13蛋白的表达，与mRNA水平检测结果一致（P＜0.05）。这表明IL-6可能通过上调Cyp1A2、Cyp2A6和Cyp2A13的表达，促进AFG1在A549细胞中的代谢活化，加剧A549细胞DNA损伤。　　5、STAT3通路在AFG1和IL-6联合作用上调P450活性和诱导A549细胞氧化应激损伤中的作用　　5.1 AFG1和IL-6联合作用对STAT3信号通路激活的影响　　Western Blot结果表明，AFG1和IL-6联合处理组p-Stat3蛋白在细胞核中表达明显增高(P＜0.05)。　　5.2 STAT3特异性阻断剂(Cpd188)预处理预处理在AFG1和IL-6联合作用上调P450活性和诱导A549细胞氧化应激损伤中的作用　　Western Blot结果表明，联合处理组中高表达的p-Stat3可被Cpd188有效抑制(P＜0.05)。给予Cpd188预处理后，联合处理组中Cyp1A2、Cyp2A6和γH2AX的蛋白表达明显低于未经Cpd188预处理的联合作用组(P＜0.05)，而Cyp2A13并没有明显差异。　　另外，用Real-time PCR方法检测了经Cpd188预处理的联合组中A549细胞Cyp1A2、Cyp2A6、Cyp2A13的mRNA水平，结果与蛋白水平表达一致。表明IL-6通过激活STAT3信号通路上调A549细胞中Cyp1A2和Cyp2A6的表达，促进AFG1在细胞中的活化而加剧A549细胞的DAN双链断裂损伤。但IL-6不通过STAT3通过调控Cyp2A13的表达。　　5.3 STAT3siRNA干扰在AFG1和IL-6联合作用上调P450活性和诱导A549细胞氧化应激损伤中的作用　　FCM检测结果发现，Stat3siRNA+4μg/ml AFG1+20μg/ml IL-6处理组中A549细胞的ROS生成明显低于NCsiRNA+4μg/ml AFG1+20μg/ml IL-6处理组（P＜0.05）。　　Western Blot检测结果发现，Stat3 siRNA+AFG1+IL-6处理组中Cyp1A2、Cyp2A6和γH2AX的蛋白水平明显低于NCsiRNA+AFG1+IL-6处理组(P＜0.05)。进一步证明提示IL-6通过STAT3信号通路上调A549细胞中Cyp1A2和Cyp2A6，促进AFG1诱导的AT-Ⅱ细胞DNA双链断裂损伤。　　6、AFG1和IL-6联合作用对于A549细胞存活的影响　　MTT检测结果显示，AFG1与IL-6联合处理与AFG1单独处理相比对A549细胞的存活没有影响。　　Western Blot方法检测跟凋亡和增殖相关的蛋白（包括BCL-XL、CyclinD1、Bax的表达），结果显示，这些蛋白在IL-6和AFG1联合作用组的表达明显高于AFG1单独处理组(P＜0.05)。提示IL-6一方面促进AFG1致AT-Ⅱ细胞氧化应激损伤，同时激活与增殖相关蛋白，促进细胞存活，在慢性炎症微环境中，这种效应可以导致DNA损伤细胞增加。　　综上所述，我们认为在AFG1诱导的慢性炎症反应中，除了AFG1本身可以诱导AT-Ⅱ细胞氧化应激损伤外，IL-6激活STAT3信号通路，上调Cyp1A2和Cyp2A6表达，促进AFG1代谢活化，进一步提高细胞内氧化应激反应，加剧细胞的DNA损伤，而IL-6同时激活增殖相关蛋白，诱导DNA损伤细胞存活，进而增加细胞突变几率。　　结论:　　1、IL-6可以增强AFG1诱导的氧化应激反应，增加AT-Ⅱ细胞DNA双链断裂损伤。　　2、在AFG1诱导的慢性炎症微环境中，IL-6可能通过上调Cyp450酶的表达，增强AFG1在A549细胞中的活化。　　3、IL-6通过激活STAT3信号通路，上调Cyp1A2和Cyp2A6的表达，促进AFG1代谢活化，进而加剧DNA双链断裂损伤。　　4、在AFG1诱导的炎症微环境中，AFG1与IL-6联合作用加剧AT-Ⅱ细胞的DNA损伤，可能增加细胞突变而发生癌变的几率。