小麦A、B、D基因组叶绿素酶1基因(TaCLH1)的克隆、表达及功能标记开发

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叶绿素是植物捕获光能、行使光合作用功能的关键色素,叶绿素降解是植物叶片衰老最明显的标志。衰老引起的植物叶片同化功能的衰退会极大程度地限制作物产量潜力的发挥。叶绿素酶是叶绿素降解过程中的关键酶之一,能将叶绿素a水解为脱植基叶绿素a。前人研究发现不同作物或同一作物不同品种或不同家族成员的叶绿素酶基因在衰老过程中的作用存在差异,小麦的叶绿素酶基因包括叶绿素酶1和叶绿素酶2两个家族成员,但在衰老过程中的作用尚不清楚。因此克隆小麦叶绿素酶1基因,分析其在叶片衰老过程中的表达特性,可为进一步研究其功能和作用奠定基础。本研究以小麦品种中麦175为材料,从A、B、D三个基因组中分离鉴定出叶绿素酶1基因(TaCLH1),并进行序列多态性分析和分子标记开发,同时分析其在不同激素处理和自然衰老过程中的表达特性;测定自然衰老过程中,小麦叶片叶绿素a和叶绿素b的含量、SPAD值,通过对比分析推断其在叶绿素降解过程中的作用。主要研究结果如下:1.克隆得到了小麦TaCLH1的三个同源基因编码区序列,全长分别为1118 bp、1161bp和1126 bp,定位在第六条染色体的短臂上。同源比对发现他们之间的同源性高达93.26%,基因结构分析表明三个同源基因均包含2个外显子,1个内含子,分别编码315、317和319个氨基酸。保守结构域分析发现均编码高度保守的α/β水解酶超家族结构域蛋白。2.利用32份多态性较高的材料分析TaCLH1三个同源基因的序列多态性,发现TaCLH1-6A和TaCLH1-6B序列均比较保守,不存在多态性位点。而TaCLH1-6B的序列多态性较高,共发现了21个SNP和5个In Del,形成三种单倍型TaCLH1-6B-Hap1、TaCLH1-6B-Hap2和TaCLH1-6B-Hap3。基于多态性位点开发了两个CAPS分子标记:TaCLH1-6B-SacⅡ-CAPS和TaCLH1-6B-NsiⅠ-CAPS,用以区分三种单倍型。3.分析TaCLH1s基因在不同器官中的表达特性,发现在叶片中的表达量最高,其它器官均较低;对小麦叶片进行ABA和Me JA处理,发现TaCLH1s基因的表达均在12 h达到最高,而后下降,最后恢复到处理前水平;对小麦叶片进行SA处理,发现TaCLH1s基因的表达变化并没有一定的规律可循;对小麦叶片进行6-BA处理,发现TaCLH1s的表达量于6 h达到最低,而在黑暗处理时在12 h达到最低,然后升高,均在24 h达到最大,最后又下降到处理前水平;在自然衰老过程中随着叶片的衰老,TaCLH1s的表达先逐渐下降,在花后20 d降到最低,而后又增加。4.测定自然衰老过程中小麦叶片叶绿素a和叶绿素b的含量以及SPAD值,发现均在花后17 d之前基本保持不变,花后18 d时开始衰老,花后23 d-24 d时衰老速率达到最大,花后26 d时终止衰老。5.对比分析自然衰老过程中,叶绿素a和叶绿素b的含量、SPAD值与TaCLH1s基因的表达特性,初步推断TaCLH1在叶绿素降解过程中的作用较小且是在叶片衰老的后期起作用。
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