灰葡萄孢BcKMO基因对病菌生长发育和致病力的影响

来源 :河北农业大学 | 被引量 : 1次 | 上传用户:nml5136
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通过筛选灰葡萄孢ATMT突变体库,从中获得了一株致病力增强的突变体BCG183,通过对该突变体的致病力和表型进行分析,发现该突变体致病力增强,在PDA培养基上菌丝生长缓慢,不产生分生孢子和菌核,菌丝较野生型变细,明确了其突变基因为BcKMO,为了进一步证实该突变基因在灰葡萄孢菌丝生长、分生孢子及菌核产生、致病过程中的作用,我们利用生物信息学方法,对突变基因及其编码产物进行了分析;利用PEG介导的原生质体转化方法,在BcKMO基因T-DNA插入突变体(BCG183)的基础上,创制了该基因的回复突变体(BCG183/BcKMO)。对野生型、突变体BCG183和回复突变体BCG183/BcKMO的菌落、菌丝形态、生长速度、分生孢子产量、致病能力和主要的致病因子(胞壁降解酶活性、毒素致病能力、致病相关基因表达水平等)进行了比较研究,主要结果如下:1. BcKMO,基因全长1221bp,无内含子,编码406个氨基酸的犬尿氨酸单氧酶(kynurenine3-monooxygenase, KMO),含有单氧酶FAD的保守结构域和4个类似芳香环羟化酶基序,具有NADPH氧化酶活性。系统发育结果表明BcKMO与核盘菌(Sclerotinia sclerotiorum)的gi563295659和从线嘴壳(Ophiostoma piceae)的gi512192943基因亲缘关系较近。2.突变体BCG183在PDA培养基上生长缓慢,不产生分生孢子和菌核,菌丝较野生型变细且致密;而野生型和回复突变体BCG183/BcKMO生长速度基本一致,均能产生分生孢子和菌核;突变体BCG183在芸豆叶片和黄瓜叶片上的致病力明显高于野生型和回复突变体。3.突变体BCG183产生的多聚半乳糖醛酸酶(PG)、聚甲基半乳糖醛酸酶(PMG)活性均较野生型和回复突变体(BCG183/BcKMO)明显增强,但纤维素酶(Cx)、果胶甲基反式消除酶(PMGE)、多聚半乳糖醛酸反式消除酶(PGTE)活性与野生型和回复突变体没有明显差别;突变体BCG183的毒素活性较野生型和回复突变体明显增强;突变体BCG183的产酸能力较野生型和回复突变体(BCG183/BcKMO)明显减弱;野生型、突变体BCG183和回复突变体BCG183/BcKMO均能穿透洋葱表皮。4.利用Real-Time PCR技术检测野生型、突变体BCG183、回复突变体BCG183/BcKMO中致病相关基因(bac、bcg2、bcg3、PkaR、bmp1、Sak1、bcreg1、bos1、bcp1、Ras2、Bcpg1和Sod1)的表达情况,结果发现突变体BCG183中各致病相关基因的表达水平均明显强于野生型和回复突变体。
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