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研究背景及目的免疫疗法在肿瘤治疗中日渐兴起,然而临床效果却不令人满意,其原因之一在于肿瘤诱导的免疫耐受。研究发现肿瘤免疫耐受的产生与髓系来源抑制性细胞(MDSCs)的聚集相关。MDSCs是一类具有免疫抑制活性的细胞群体,能通过多种方式抑制机体免疫,包括表达免疫抑制活性酶类。MDSCs一旦在肿瘤微环境中发生分化受阻、聚集,将不利于机体的抗肿瘤免疫。目前关于MDSCs的产生、分化及功能的调控是肿瘤免疫学的研究重点。Toll样受体4(TLR4)是重要的免疫分子,能识别细菌外膜成分脂多糖(LPS),主要分布在髓系细胞表面,参与调节髓系细胞的免疫功能。近来有报道称在4T1乳腺癌荷瘤小鼠及正常小鼠体内的MDSCs表面也发现了TLR4表达,并认为TLR4可能是MDSCs产生、分化及功能的潜在调控靶点。细胞毒药物紫杉醇是新近发现的TLR4的潜在配体,研究认为紫杉醇可能通过调控表达TLR4的免疫细胞参与机体的抗肿瘤免疫调节,并且已在树突状细胞与巨噬细胞的相关研究中得到证实,那么,紫杉醇是否也能通过影响表达TLR4的MDSCs来调节宿主的免疫功能?并且,同样作为TLR4的配体,紫杉醇与LPS对MDSCs的作用有何异同?均有待阐明。故本课题拟首先鉴定并分选Lewis肺癌小鼠脾脏中的MDSCs,了解此来源的MDSCs上TLR4的表达状况,检测LPS及紫杉醇处理后MDSCs凋亡、成熟和免疫功能的变化,本课题的研究结果将有助于进一步阐明TLR4与MDSCs间的关系,并对紫杉醇的抗肿瘤免疫功能提供新的认识。研究方法1.荧光抗体标记Lewis肺癌小鼠及正常小鼠脾脏单个核细胞,流式细胞仪(FCM)检测细胞表面分子CD11b和Gr-1、分化抗原CD11c和F4/80、组织相容性复合物MHC-Ⅱ、协同共刺激分子CD86的表达。(鉴定MDSCs的表面标志)。2.利用相应的免疫磁珠分选Lewis肺癌小鼠脾脏中的MDSCs。3.建立混合淋巴细胞反应体系(MLR),体外鉴定分选所得MDSCs的免疫抑制功能。4. RT-PCR检测MDSCs中TLR4基因的表达；FCM检测MDSCs表面TLR4蛋白的表达。5. AnnexinV+PI法检测LPS及紫杉醇作用后MDSCs的凋亡；FCM检测Lewis肺癌小鼠腹腔注射紫杉醇后其脾脏中MDSCs比例的变化。6.FCM检测LPS及紫杉醇作用后MDSCs表面组织相容性复合物MHC-Ⅱ及协同共刺激分子CD86的表达。7.MLR检测LPS及紫杉醇作用后MDSCs的免疫抑制功能。8. Western Blot检测LPS及紫杉醇处理后MDSCs胞内免疫抑制活性酶类精氨酸酶1(ARG1)的表达。研究结果1. Lewis肺癌小鼠脾脏内CD11b/Gr-1双阳性细胞明显增多,占脾脏单个核细胞的(42.53+6.26)%。Lewis肺癌小鼠脾脏来源CDllb/Gr-1双阳性细胞表面CD11c、F4/80、MHC-Ⅱ及CD86的表达均较正常小鼠低,分别为(11.67±3.01)%Vs(24.67±4.02)%,p=0.01;(14.33±3.33)%vs(27.00±4.21)%,p=0.01；(8.66±2.33)%vs(30.00±3.51)%,p=0.001；(14.67±3.76)%vs(32.00±4.73)%,p=0.007。2.免疫磁珠分选所得阳性细胞中CDllb/Gr-1双阳性细胞比例大于90%,而分选所得阴性细胞中CD11b/Gr-1双阳性细胞少于1%。3.与对照组相比,包含Lewis肺癌小鼠脾脏来源CD11b/Gr-1双阳性细胞的实验组中淋巴细胞的增殖率明显降低,(14.67±3.76)%vs(45.30±7.26)%,p=0.02。4. Lewis肺癌小鼠脾脏来源CD11b+Gr-1+MDSCs表面存在TLR4表达。5. 0.1μg/ml LPS或1μg/ml LPS作用48小时后CDllb+Gr-1+MDSCs的凋亡较对照组降低,分别为(9.83±2.36)%vs(23.93±4.67)%,p0.1μg/ml=0.007；(8.00±2.64)%vs(23.93±4.67)%,p1μg/ml=0.004,而不同浓度LPS组间差异无统计学意义。当LPS作用24小时后,三组间凋亡差异无统计学意义。6. 1μg/ml LPS作用后CDllb+Gr-1+MDSCs表面MHC-Ⅱ和CD86的表达较对照组降低,分别为(15.33±3.78)%vs(34.66±3.78)%,pMHC-Ⅱ=0.002；(18.48±3.51)%vs(31.23±3.60)%,pCD86=0.01。而0.1μg/ml LPS作用后MHC-Ⅱ和CD86的表达与对照组相比差异无统计学意义。7. 1μg/ml LPS作用后CD11b+Gr-1+MDSCs对淋巴细胞增殖的抑制较对照组增加,抑制率分别为(44.33±9.71)%vs(19.33±5.52)%,p1:1=0.01；(34.66±7.76)%vs(17.66±4.52)%,p1：2=0.03(1：1和1：2为CD11b+Gr-1+MDSCs在MLR中的稀释比例)。而0.1μg/ml LPS组与对照组相比抑制率差异无统计学意义。8. 0.1μg/ml LPS或1μg/ml LPS均能诱导CD11b+Gr-1+MDSCs胞内免疫抑制酶类ARG1表达增高。9. Lewis肺癌小鼠腹腔注射20mg/kg紫杉醇后脾脏中CD11b+Gr-1+MDSCs的比例较未注射组降低,(28.64±5.45)%vs(42.58±5.06)%,p=0.03。10.30ng/ml紫杉醇或300ng/ml紫杉醇作用后CD11b+Gr-1+MDSCs的凋亡均较对照组增加,凋亡率分别为(21.46±6.76)%vs(4.53±0.90)%,p24小时/30ng/ml=0.01；(38.96±5.47)%vs(4.53±0.90)%,p24小时/300ng/ml=0.001；(38.70±4.21)%vs(23.93±4.67)%；p48小时/30ng/ml=0.04；(55.03±6.65)%vs(23.93±4.67)%,p48小时/300ng/ml=0.009。不同浓度紫杉醇组间MDSCs的凋亡率差异具有统计学差异,P24小时=0.01、p48小时=0.02。11.30ng/ml紫杉醇或300ng/ml紫杉醇作用后CD11b+Gr-1+MDSCs表面MHC-Ⅱ的表达分别为(36.34±5.35)%、(42.12±5.56)%,CD86的表达分别为(42.00±6.35)%、(31.12±4.83)%,与对照组相比差异均无统计学意义。12.30ng/ml紫杉醇或300ng/ml紫杉醇作用后CD11b+Gr-1+MDSCs对淋巴细胞增殖的抑制较对照组降低,抑制率分别为(12.0±4.87)%vs(25.56±6.56)%,p30ng/ml=0.04；(10.22±4.52)%vs(25.56±6.56)%,p300ng/ml=0.02。13.30ng/ml紫杉醇或300ng/ml紫杉醇均不会影响CD11b+Gr-1+MDSCs胞内ARG1的表达。研究结论1.与正常小鼠相比,Lewis肺癌小鼠脾脏中聚集了大量的CD11b/Gr-1双阳性细胞,且该双阳性细胞分化受阻、成熟障碍,并在体外能抑制淋巴细胞的增殖,符合MDSCs的生物特征。2. Lewis肺癌小鼠脾脏来源CD11b+Gr-1+MDSCs表面存在TLR4的表达。TLR4配体LPS作用后能增加CD11b+Gr-1+MDSCs在体外的抗凋亡能力,抑制CD11b+Gr-1+MDSCs分化成熟,增加CD11b+Gr-1+MDSCs胞内免疫抑制活性酶ARG1的表达,最终增强CD11b+Gr-1+MDSCs的免疫抑制功能。3.紫杉醇对CD11b+Gr-1+MDSCs的作用与LPS不一致,紫杉醇在体内外均能够杀伤CD11b+Gr-1+MDSCs,降低CD11b+Gr-1+MDSCs的免疫抑制功能,但不影响CD11b+Gr-1+MDSCs的分化成熟及其胞内免疫抑制酶ARG1的表达。