研究背景原发性肝癌是最常见的侵袭性肿瘤之一。据国际癌症中心（IARC）统计,每年约有85万肝癌新发病例。肝细胞肝癌（Hepatocellular carcinoma,HCC）是原发性肝癌的绝对主要类型。尽管HCC治疗技术的进步显著延长了肝癌患者的生存期,但肝癌病人的死亡率仍然居高不下。转移是肝癌患者死亡的主要原因。目前临床常用的治疗方法如外科手术及放、化疗对肝癌肺转移难以达到理想的治疗效果。已知,肝癌转移是由多步骤、多因素共同参与的复杂过程,受到多种信号通路及细胞增殖、侵袭、运动和粘附等相关分子的调控。虽然肝癌转移一直是国内外相关领域的研究热点,但其具体的发生机制目前尚未完全阐明。铁是一切生命体不可缺少的微量元素,在氧的转运和利用过程中有重要作用。研究表明,铁缺乏和铁过负荷均会导致机体疾病。值得注意的是,包括我们课题组在内的国内外众多研究均发现,肝癌患者及化学试剂诱导小鼠原发性肝癌的癌组织中铁含量显著降低。即使是在铁超负荷引起的肝癌中,癌组织的铁含量也较癌旁组织明显降低。更有意义的是我们课题组前期通过体内外实验证实,低铁促进肝癌细胞肺转移且肝癌组织低铁的患者5年生存率明显降低。因此,我们认为,阐明肝癌组织低铁的发生机制,对肝癌转移的预防、治疗以及肝癌病人的预后具有重要意义。研究目的通过观察肝癌患者、实验动物肝癌发生过程中癌组织和正常（癌旁）肝组织铁含量以及铁代谢蛋白表达的变化,分析可能导致肝癌组织低铁的关键铁代谢蛋白,并通过体内外实验证实该蛋白表达变化对肝组织细胞乃至全身铁稳态的影响。为全面了解肝癌组织低铁的原因以及制定相应的预防、治疗措施提供线索。研究方法一、细胞实验（一）细胞培养人肝癌细胞Huh7、HepG2和小鼠肝癌细胞Hepa1-6由含10%胎牛血清（Gibco）和1%双抗（Gibco）的高糖DMEM培养液（Hyclone）培养;肝细胞L02培养于含10%胎牛血清和1%双抗的1640培养液（Sigma）;人原代肝细胞培养于含5%胎牛血清（Sciencell）、1%双抗（Sciencell）和1%肝细胞生长添加物（Sciencell）的肝细胞培养基中。细胞放置于37℃,5%二氧化碳的培养箱中。（二）细胞处理铁螯合剂DFO的使用浓度为0、50、100、200μM,暴露时间为24小时。血红素的使用浓度为30μM,暴露时间为24小时。Holo-Tf的使用浓度为30μM,暴露时间为24小时。（三）细胞内铁含量的检测利用Biovision公司的铁比色测定试剂盒（K390-100）检测细胞内的铁含量。（四）细胞转染采用Lipo3000对干扰RNA、过表达质粒进行细胞转染,干扰RNA的浓度为100μM,过表达质粒浓度为1ug/ul,具体转染用量和步骤参考Lipo3000说明书,转染时间48小时。二、动物实验（一）动物饲养C57小鼠、Wistar大鼠以及喂食饲料均购自第二军医大学动物中心,实验操作遵循实验动物人文关怀规范。饲养温度维持在25℃左右,湿度在50%左右。昼夜光照交替。保持饲养环境清洁卫生。（二）大鼠肝细胞肝癌模型七周龄雄性Wistar大鼠,分为实验组和对照组。对照组共6只:予以PBS腹腔注射0.5ml,每周一次;实验组共10只:按大鼠体重50mg/kg的剂量腹腔注射DEN 0.5ml,每周一次。连续注射16周,额外增加两周空白洗脱期后处死。（三）小鼠肝细胞肝癌模型2周大雄性C57小鼠,随机分成对照组和DEN组,对照组予以PBS单剂量腹腔注射0.1ml;实验组小鼠按25mg/kg体重单剂量腹腔注射DEN 0.1ml。从腹腔注射之日算起,于1月、3月、5月、7月、9月处死小鼠,保证各时间点上每组至少5只小鼠。（四）肝脏HCP1干扰、过表达小鼠模型将16只六周龄大的C57雄鼠随机分成四组:空白对照组、阴性对照组、肝脏特异性干扰HCP1组、肝脏特异性过表达HCP1组,每组四只。腺相关病毒AAV-8通过尾静脉注射,注射剂量为:阴性对照病毒:5×10¹¹vgs;HCP1干扰病毒:2×10¹²vgs;HCP1过表达病毒:1×10¹²vgs。自注射病毒之日起第6周处死。（五）血清相关指标检测室温下凝血半小时,4℃,3000g离心20min,小心吸取血清。血清铁、转铁蛋白饱和度、总铁结合力由全自动生化分析仪测得;血清甲胎蛋白利用ELISA试剂盒检测,血红素由QuantiChrom试剂盒检测。（六）鼠肝组织HE、GFP染色三、肝癌患者癌组织、癌旁组织蛋白提取及表达检测全蛋白提取试剂盒提取12例肝癌患者癌组织、癌旁组织全蛋白,利用Western Blot检测铁代谢蛋白的表达水平。四、统计方法图表中的实验数据按照均数±标准误（Mean±SEM）的方式呈现。经验证,总体服从正态分布。各组数据符合方差齐性,两组比较时采用t检验,多组比较时采用方差分析。若各组数据不符合方差齐性,两组比较时采取Mann-Whitney检验,多组比较采取Kruskal-Wallis检验。当P值<0.05时,差异被认为具有统计学意义。研究结果一、肝癌组织肝癌细胞铁稳态及其调控分子的表达变化（一）人肝癌组织、癌旁组织铁含量和铁代谢蛋白的表达特点为了探究肝癌组织低铁的原因,我们首先对肝癌患者癌组织、癌旁组织中主要的铁代谢蛋白的表达水平进行了检测。结果显示,与癌旁组织相比,肝癌组织转铁蛋白受体1（TFR1）、膜铁转运蛋白（FPN）表达水平明显升高;Steap3、二价阳离子转运体（DMT1）、血红素转运体（HCP1）和铁调素（Hepcidin）表达水平明显降低。（二）大鼠肝癌组织、正常肝组织铁含量和铁代谢蛋白的表达特点我们进一步检测了大鼠肝癌组织的肝铁含量和铁代谢蛋白的表达变化,与正常肝组织相比,肝癌组织铁含量明显降低,同时,癌组织TFR1表达明显升高,Hepcidin、FPN、DMT1、Steap3、HCP1表达明显降低。（三）小鼠肝癌形成过程中肝铁含量和铁代谢蛋白的表达变化为了了解在肝癌形成过程中铁代谢蛋白的表达变化与肝铁含量变化,我们通过腹腔注射DEN诱导小鼠肝细胞肝癌,并在1、3、5、7、9月5个时间点肉眼观察肝脏是否存在肿瘤结节、HE染色观察肝细胞形态来判断肝癌形成与否,同时检测相应时间段的肝铁含量和铁代谢蛋白的表达变化。结果显示,1、3、5月实验组小鼠未见明显的肝肿瘤结节,7月时实验组部分小鼠可见明显的肝肿瘤结节,9月实验组全部小鼠可见明显的肝肿瘤结节。结果还显示,1、3、5月实验组小鼠的肝铁含量及铁代谢蛋白表达量较同时间点对照组无明显差异。但7、9月实验组小鼠肝癌组织与对照组相比,与自身癌旁组织及正常肝组织相比,铁含量均显著降低,TFR1表达均明显升高,Hepcidin、FPN、Steap3、DMT1和HCP1表达均明显下降。（四）肝癌细胞缺铁实验中铁代谢蛋白的表达特点为了进一步了解铁代谢蛋白表达是否为肝癌组织低铁的影响因素,我们在肝癌细胞HepG2、Huh7上添加铁螯合剂DFO,人为造成肝癌细胞低铁。结果显示,HepG2、Huh7等肝癌细胞缺铁时,TFR1、FPN、Steap3、DMT1、HCP1表达水平升高,Hepcidin表达降低。上述结果与肝癌患者以及肝癌动物模型相比,Steap3、DMT1和HCP1这三个铁代谢蛋白的表达变化明显不同。即缺铁可以引起Steap3、DMT1和HCP1表达升高,而不是降低。二、HCP1对肝组织细胞及系统铁稳态影响的体内外实验（一）干扰Steap3、DMT1和HCP1后予以Holo-Tf培养,肝细胞内铁含量不变为了进一步了解癌组织中Steap3、DMT1和HCP1的降低与肝癌低铁的关系,我们观察了这三个分子表达变化对肝细胞铁含量的影响。转铁蛋白结合铁Holo-Tf是机体大多数组织细胞获取铁的主要形式,因此我们首先通过分别干扰HepG2、Huh7等肝癌细胞Steap3、DMT1或HCP1后添加Holo-Tf暴露24小时检测细胞内铁含量。结果显示,暴露组与各自对照组细胞内的铁含量无明显差异。由于Steap3和DMT1在转运Holo-Tf的通路中分别位于上下游,我们又在HepG2、Huh7等细胞上同时干扰Steap3和DMT1后添加Holo-Tf培养,检测结果显示,暴露组细胞内铁含量较各自的对照组无明显差异。上述结果表明,Steap3、DMT1和HCP1的表达下降不是通过影响Holo-Tf的吸收引起细胞内铁含量的改变。（二）干扰、过表达HCP1的肝细胞经血红素培养,细胞内铁含量改变血红素是机体铁的重要存在形式之一,肝细胞HCP1表达变化否能够影响肝细胞的铁稳态尚未见报道。我们课题组在前期研究发现肝细胞L02能够通过HCP1摄取血红素而改变细胞内铁含量。本实验中我们进一步扩大肝细胞类型,采用人原代肝细胞和人肝癌细胞Huh7、HepG2以及小鼠肝癌细胞Hepa1-6添加血红素暴露24小时,结果显示,上述各种细胞株细胞内铁含量均明显增加。在此基础上,我们通过SiRNA方法干扰了人原代肝细胞和人肝癌细胞Huh7、HepG2以及小鼠肝癌细胞Hepa1-6的HCP1后添加血红素暴露24小时,结果显示,暴露组较各自对照组细胞内铁含量明显降低。而利用质粒过表达人原代肝细胞和肝癌细胞Huh7、HepG2、Hepa1-6的HCP1后添加血红素暴露24小时的结果显示,过表达组细胞内铁含量较各自对照组明显升高。（三）肝脏HCP1的表达变化可影响肝组织及全身铁稳态为了进一步了解实验动物肝组织HCP1表达变化是否可以影响肝脏铁稳态,我们通过AAV8靶向干扰、过表达小鼠肝脏HCP1。结果显示,与空白对照组和阴性对照组相比,干扰组小鼠肝铁含量明显降低且肝组织Hepcidin水平下降,FPN表达升高,与肝脏低铁研究中发现的上述分子表达变化一致。血清检测结果显示,干扰组小鼠血清铁、转铁蛋白饱和度、血红素升高。但过表达组小鼠肝铁含量、血清铁水平及肝组织中铁代谢蛋白的表达水平较对照组均无明显差异。结论1.本研究通过比较人、大鼠小鼠肝癌、癌旁组织铁含量及铁代谢蛋白的表达特点,再次证实肝癌组织低铁,且与癌旁和正常肝组织相比,肝癌组织铁代谢蛋白表达改变。结合肝癌细胞缺铁实验,提示,铁代谢蛋白Steap3、DMT1和HCP1在癌组织中的降低可能不是低铁所引起的。2.细胞实验表明干扰Steap3、DMT1和HCP1的表达均不会通过影响Holo-Tf的转运进而引起细胞铁含量的变化。但是,我们首次通过体内外实验证实,肝细胞HCP1表达变化可以通过影响血红素的吸收进而改变细胞内的铁含量,并对系统性铁稳态产生影响。结合两部分研究结果,推测,肝癌组织HCP1表达下降可能是肝癌低铁的原因之一。当然,有关HCP1在癌组织中的表达降低是否为肝癌组织低铁的主要原因还有待进一步研究。