论文部分内容阅读
轮状病毒(Rotavirus,RV)属于呼肠病毒科(Reoviridae)轮状病毒属(Rotavirus)成员,是重要的病原体,可以引起多种宿主生物的病毒性腹泻,如哺乳动物和鸟类。猪轮状病毒(Porcine Rotavirus,Po RV)是引起仔猪腹泻、呕吐、脱水等症状的主要病原,致死率高,为猪的主要传染病之一,使我国的养猪业遭受了沉重的打击。RV为双链的RNA病毒,RV基因组是由11段每段均含有一个开放阅读框、不连续的双股RNA所构成,并编码6种结构蛋白以及6种非结构蛋白。NSP3是RV的非结构蛋白,是一种非糖基化蛋白,该蛋白与病毒粒子感染细胞有关,能够关闭宿主细胞mRNA的翻译。非结构蛋白NSP5,主要功能是糖基化和磷酸化的修饰作用,多在RV翻译后期进行参与。其C端富含保守的丝氨酸和苏氨酸多聚化结构域,参与翻译后期的磷酸化和糖基化修饰,NSP5的存在可使病毒的复制转录等过程顺利进行,在病毒的复制周期中起着不可或缺的作用。本研究旨在获得抗Po RV(G9)血清型NMTL毒株纯度高特异性强的单克隆抗体(MAb),加深对NSP3、NSP5蛋白结构和功能的了解,并对它们的免疫学特性进行了更深一步的研究。本研究采用RT-PCR方法扩增了G9血清型NSP3和NSP5基因,经酶切后分别连接至p GEX-6P-1载体中构建重组表达质粒p GEX-NSP3和p GEX-NSP5。酶切鉴定后进行测序,获得测序正确的阳性质粒。将其分别转化至E.coli DH5α感受态细胞,经IPTG进行NSP3重组蛋白(r NSP3)和NSP5重组蛋白(r NSP5)的诱导表达,并设置空载体为对照。将r NSP3和r NSP5经SDS-PAGE分析后进行纯化,结果显示:r NSP3和r NSP5大小分别为60Ku和50Ku。将rNSP3和r NSP5分别与抗RV的阳性血清进行western blot试验,均发生反应,结果表明其具有良好的免疫源性。将含有r NSP3和r NSP5条带的SDS-PAGE胶捣碎后,采用皮下注射的方法免疫BALB/c小鼠,免疫3次后断尾取血,间接ELISA检测抗体效价后,进行加强免疫于融合的前3d。取加强免疫后小鼠的脾细胞与生长状态较好的骨髓瘤细胞(SP2/0)进行融合,利用间接ELISA方法进行筛选,得到1株能稳定分泌抗Po RV(G9)NSP3的杂交瘤细胞株5B8和1株能稳定分泌抗NSP5的杂交瘤细胞株5E11,均为Ig G1亚类。Western blot及间接免疫荧光(IFA)结果表明,所获得的MAbs特异性良好。为确定获得的MAb所针对的抗原表位的区域序列,采用Western blot试验分别对截短表达后的NSP3和NSP5蛋白进行一系列的鉴定。结果表明,5B8识别的抗原表位序列为290QDYDRTFL 297,5E11识别的抗原表位序列为61 GPSDSA 66。本研究分别成功制备了一株抗NSP3蛋白和一株抗NSP5蛋白的MAb,并对它们的线性抗原表位进行了鉴定。为RV的抗病毒免疫研究、抗体检测等均提供了信息及材料,同时也为进一步对NSP3和NSP5蛋白的结构和功能的研究奠定了良好的基础。