研究背景和目的结直肠癌是常见的消化道恶性肿瘤之一,发病率仅次于食管癌与胃癌。在我国,随着生活水平提高,饮食习惯改变,结直肠癌的总体发病率也呈上升趋势。大量研究表明,miRNA的异常表达与结直肠癌的发生发展存在密切关系。microRNA是真核生物体内一类对基因转录后水平调控的非编码单链小分子RNA,长度约22个核酸,可以与mRNA的3’UTR区结合,调控着人类近三分之一基因的功能,几乎参与一切重要生命活动和大多疾病的发病过程。miRNA在调节细胞早期发育、增殖、分化、凋亡等多种生物进程中起关键作用。研究表明miRNA在肿瘤进程中扮演重要的角色,很多miRNA扮演着癌基因和抑癌基因的角色。Michael等首次报道结直肠腺瘤及癌组织中miR-143和miR-145表达降低；let-7是在发育及癌症研究最多的miRNA,最近的研究表明let-7调节转移相关基因MYH9和CC趋化因子受体7(CCR7)促进肿瘤细胞的侵袭能力；Johnson等人报道let-7在肺癌中表达下调,并与ras基因表达升高有关；miRNA功能失调可能有助于多种恶性肿瘤的起始和进展,包括乳腺癌、肝癌、胃癌、肺癌和结直肠癌等。2009年Bostjancic E等通过qRT-PCR分析证实miR-186在心血管疾病中失调,并参与多种生理与病理学过程；有研究证实,miR-186在肿瘤上皮细胞中表达增加降低了P2X7的mRNA水平；最近有文献报道miR-186在非小细胞肺癌中通过抑制Cyclin D1(CCND1)、cyclin-dependent kinase (CDK)2和CDK6发挥重要的肿瘤抑制作用；在结直肠癌中miR-186, miR-216b, miR-337-3p和miR-760通过靶向抑制CKⅡα协同诱导细胞凋亡；另外miR-186在肝硬化及肝癌前病变中上调,在子宫内膜癌中通过靶向FOXO1发挥癌基因的作用；但在结肠癌发生发展中的作用及机制研究尚未见报道,因此本文的研究目的为鉴定miR-186在结直肠组织及细胞中的表达特性,通过改变miR-186的表达水平观察对于结肠癌细胞生物学特性的影响,进一步结合生物信息学软件预测和分析其靶基因,探讨miR-186作用的分子机制。研究方法1.miR-186在结直肠癌组织和细胞中表达采用荧光定量RT-PCR方法检测12对配对的结直肠癌组织和5株HT-29、HCT-116、LS174T、SW620和LOVO结直肠癌细胞中miR-186的表达。2.瞬时转染miR-186对结直肠癌细胞生物学特性的影响(1)采用荧光定量RT-PCR检测结直肠癌细胞中瞬时转染miR-186inhibitor/mimics后miR-186的表达水平；(2)利用CCK8细胞增殖实验、Transwell细胞迁移实验检测瞬时转染miR-186inhibitor/mimics对结直肠癌细胞增殖和迁移能力的影响。3.miR-186过表达对结直肠癌细胞生物学特性的影响(1)通过扩增包含hsa-miR-186前体序列在内的基因片段,构建慢病毒表达载体pLVTHM/miR-186;(2)病毒包装后感染SW620细胞,流式细胞仪分选鉴定GFP+细胞,建立稳定表达miR-186的结直肠癌细胞株SW620/pLVTHM-miRl86;(3)利用CCK8细胞增殖实验、平板克隆形成实验、Transwell细胞侵袭实验、划痕实验和凋亡实验检测miR-186过表达对SW620细胞增殖、迁移、侵袭和凋亡的影响。(4)裸鼠皮下成瘤实验：过表达miR-186的SW620/miR-186细胞组和对照组细胞SW620/pLVTHM,将SW620/pLVTHM细胞注射到裸鼠左上背侧皮下和左下背侧皮下；将SW620/miR-186细胞注射到裸鼠右上背侧皮下和右下背侧皮下；注射总细胞数均为1.5×106个,每隔5-6天用游标卡尺测量瘤体直径,按如下公式计算肿瘤体积：V=(D×d2)/2,其中D代表肿瘤最长径,而d代表肿瘤最短径；待肿瘤体积超过500mm3或肿瘤组织出现坏死,将实验动物处死,肿瘤组织取出后经福尔马林固定,石蜡包埋,切片后HE染色,光学显微镜观察。4.miR-186靶基因的预测及作用的分子机制的初步研究(1)利用生物信息学在线网站TargetScan、Pictar和microRNA.ORG三者交集预测miR-186的靶基因,筛选miR-186的候选靶基因；(2)利用荧光定量RT-PCR检测靶基因在3种SW620细胞株中的表达；(3)利用Western Blot检测过表达miR-186细胞SW620中靶基因YY1,以及P53和EMT相关指标(E-Cadherin, Vimentin)蛋白质的表达。5.统计学分析采用SPSS13.0统计软件进行数据分析。CCK8体外增殖实验采用析因设计的方差分析。实验中涉及到两组数据之间的比较均采用两独立样本的t检验,而三组或三组以上数据的比较均采用单向方差分析(One-Way ANOVA),方差不齐时采用Welch近似方差分析；方差齐性的多重比较采用LSD法、SNK(Student-Newman-Keuls)法,方差不齐时采用Dunnett’s T3法。P<0.05为差异有统计学意义。研究结果1.miR-186在结直肠癌组织中表达荧光定量结果发现12例匹配的结肠癌组织中miR-186的平均表达量为0.0024±0.0027,显著低于癌旁组织的0.066±0.068；miR-186在结肠癌组织中的表达明显低于正常粘膜组织(t=3.209,P=0.008)。2.miR-186在5种结直肠癌细胞株中表达荧光定量PCR结果显示,以HT-29细胞为参照,方差齐性检验F=7.473,P=0.005；方差不齐故采用Welch法近似方差分析,结果表明5种细胞之间miR-186的表达差异有统计学意义(F=2510.551, P<0.001)。Dunnett T3多重比较统计结果：HT29与LS174T、SW620、Lovo有统计学差异(P<0.05),与HCT116无统计学差异(P>0.05)。3.瞬时转染miR-186对结直肠癌细胞生物学特性的影响荧光定量RT-PCR检测瞬时转染miR-186-inhibitor结直肠癌细胞HCT-116中miR-186的表达情况,统计学分析后发现miR-186在HCT-116/miR-186inhibitor和HCT-116/miR-186inhibitor nc两种细胞中的表达差异有显著性(t=8.352,P=0.001),运用2-△△Ct法计算和发现HCT-116/miR-186inhibitor细胞中的miR-186的表达水平显著降低;说明转染成功。同样miR-186在SW620/miR-186mimics和SW620/miR-186mimics nc两种细胞中的表达差异有显著性(t=-30.581,P<0.001),运用2-△△Ct法计算和发现SW620/miR-186mimics细胞中的miR-186的表达水平显著升高；说明转染成功。(1)CCK8细胞增殖实验采用CCK-8法测定结直肠癌细胞系HCT-116和SW620分别转染miR-186inhibitor和miR-186mimics后的体外的增殖能力。HCT-116和SW620转染后2个组的生长时间水平差异具有统计学意义(F=320.887,P<0.001;F=359.081,P<0.001); HCT-116和SW620细胞组间增殖能力差异具有统计学意义(F=58.101,P<0.001; F=123.103, P<0.001), HCT-116和SW620细胞时间与细胞组间交互效应差异有统计学意义(F=7.651,P=0.002；F=9.27,P=0.001)。2组细胞间同一天测得数据经独立样本t检验,HCT-116和SW620细胞除第1天(P=0.833,P=0.098)外,各时间细胞组间差异具有统计学意义(均为P<0.05)。以上结果说明,瞬时转染miR-186inhibitor促进了HCT-116细胞体外增殖；瞬时转染miR-186mimics抑制了SW620细胞体外增殖。(2) Transwell(?)、室细胞运动实验采用Transwell小室的方法检测转染miR-186inhibitor/mimics后细胞体外迁移能力的变化,经独立样本t检验的统计结果显示：HCT-116转染miR-186inhibitor和miR-186inhibitor nc后两组细胞的迁移能力差异具有显著性(t=12.350, P<0.001); HCT-116/miR-186inhibitor组迁移能力明显高于HCT-116/miR-186inhibitor nc组。SW620转染]miR-186mimics和miR-186mimics nc后两组细胞的迁移能力差异具有显著性(t=-3.666, P=0.018); SW620/miR-186mimics组迁移能力明显低于SW620/miR-186mimics nc组。4.miR-186过表达对结直肠癌细胞生物学特性的影响(1)慢病毒表达载体pLVTHM/miR-186的构建(2)筛选建立稳定过表达miR-186的细胞株Sw620(3)荧光定量PCR鉴定miR-186的表达采用荧光定量PCR检测SW620细胞中空白对照组、pLVTHM组和mir-186过表达组中mir-186的表达变化。经方差齐性检验(F=4.602,P=0.061),单向方差分析结果显示mir-186的表达差异有统计学意义(F=11.757,P=0.008)。对3组细胞进行两两比较分析后发现,miR-186的表达在SW620/miR-186高于SW620/pLVTHM和SW620(P=0.006, P=0.006);说明mir-186稳定转染成功。(4)体外功能实验a.CCK8细胞增殖实验采用CCK8法检测空白对照组、pLVTHM组和mir-186过表达组的体外增殖能力,3个组细胞的生长时间水平差异具有统计学意义(F=891.213,P<0.001)；3个组间细胞增殖能力差异具有统计学意义(F=44.575,P<0.001),细胞组间交互效应差异有统计学意义(F=4.698,P<0.001),3组细胞间同一天测得数据经单因素方差分析或Welch法近似方差分析,除第1、2天(P=0.554,P=0.743)外,各时间细胞组间差异具有统计学意义(均为P<0.05)。以上结果说明,过表达miR-186抑制了SW620细胞体外增殖。b.平板克隆形成实验平板克隆形成实验检测SW620、SW620/pLVTHM、SW620/miR-1863组细胞的克隆形成率分别为25.498%、28.880%、16.613%,克隆形成率方差齐性(F=0.196,P=0.827),单因素方差分析结果显示：SW6203组细胞间的克隆形成能力差异具有统计学意义(F=16.776, P=0.003), SW620/miR-186和SW620、 SW620/pLVTHM克隆形成率差异具有统计学意义(P=0.007; P=0.001), SW620和SW620/pLVTHM:之间差异不具有统计学意义(P=0.173)。以上结果说明,过表达miR-186抑制了SW620细胞体外增殖。c. Transwell小室细胞运动实验采用Transwell小室的方法检测miR-186过表达后细胞体外侵袭能力的变化,SW620、SW620/pLVTHM、SW620/miR-186三组细胞方差齐性检验(F=3.136,P=0.080)。单因素方差分析,三组细胞间迁移能力差异具有统计学意义(F=49.059,P<0.001)。采用LSD两两比较结果显示：SW620/miR-186细胞组穿膜细胞数少于SW620和SW620/pLVTHM细胞组(P<0.001,P<0.001)。上述实验结果表明过表达miR-186抑制结直肠癌细胞SW620的侵袭能力。d.划痕实验检测细胞迁移能力对SW620、SW620/pLVTHM、SW620/miR-186三组细胞划痕处理后,间隔24h连续观察细胞的迁移运动情况,可见SW620和SW620/pLVTHM组划痕后72h,细胞已基本完全覆盖划痕区域,而SW620/miR-186组则未完全覆盖。上述实验结果表明,过表达miR-186后抑制了结直肠癌细胞SW620迁移能力。e.流式细胞术检测细胞凋亡流式细胞术检测发现,SW620、SW620/pLVTHM、SW620/miR-1863组细胞早期凋亡率分别为2.55%、2.4%和39.45%,而对晚期凋亡的影响不是很明显,分别为2.05%、1.6%和1.8%。由此表明,过表达miR-186对SW620细胞早期凋亡影响最明显。(5)裸鼠皮下成瘤实验SW620/pLVTHM、SW620/miR-186两种细胞共接种2只裸鼠,SW620/pLVTHM组接种在裸鼠的左上、左下背侧皮下,SW620/miR-186组接种在裸鼠的右上、右下背侧皮下。接种后第6天,肉眼可见肿瘤形成。23天后处死裸鼠取出皮下肿瘤。发现SW620/miR-186组皮下瘤的生长速度更慢,相同生长时间,最终的皮下瘤体积要小于SW620/pL VTHM组的瘤体积。经析因设计的方差分析、方差齐性检验、单向方差分析和独立样本t检验的方法进行统计学分析得出两组皮下瘤生长的差异具有统计学意义,不同时间水平之间差异均具有显著性意义(F=10.594,P<0.001),分组与天数间的交互效应具有统计学意义(F=7.515,P=0.001),两两比较后发现,相同天数两组皮下瘤的差异具有统计学意义(F=17.545,P<0.001)。该结果说明过表达miR-186可降低人结直肠癌细胞SW620在免疫缺陷裸鼠的皮下成瘤能力。5.miR-186靶基因的预测及作用的分子机制的初步研究(1)应用生物信息学预测软件TargetScan、PicTar、MICRORNA.ORG对miR-186的靶基因进行预测,选择3个软件预测结果的交集作为可能的靶基因。3个网站的交集共得到200多个基因,其中包括在肿瘤的发生发展及转移过程中发挥重要作用的基因,如：IL2、RAD23B、EF300、DLG5、ATP2A2、PSME3、 YY1、CLDN1、CDC42。(2)利用Q-PCR检测靶基因YY1在SW6203中细胞株中的表达,发现YY1在SW620/miR-186细胞中的表达与SW620、SW620/pLVTHM相比均没有统计学意义(P=0.201; P=0.05)。Western blot检测miR-186过表达细胞株SW620中靶基因YY1,以及p53、EMT相关指标(E-Cadherin, Vimentin)蛋白质水平的变化。结果显示,与对照组相比过表达miR-186后靶基因YY1蛋白质水平下降,p53表达水平明显上升。SW620细胞中,与对照组相比过表达miR-186组E-Cadherin蛋白质表达上调,而Vimentin蛋白水平无明显变化。结论1.miR-186在结直肠癌组织和细胞中表达下调；2.miR-186能够抑制结直肠癌细胞的增殖、迁移、侵袭和凋亡；3.过表达miR-186抑制SW620细胞在裸鼠体内的成瘤能力；4.通过Western Blot初步证实在结直肠癌细胞中过表达miR-186可能通过抑制YY1而发挥作用。