肠激酶是由脊椎动物十二指肠细胞分泌的一种丝氨酸蛋白酶，可以特异性水解多肽序列“DDDDK”的羧基端肽键，对于胰蛋白酶原的激活有重要作用。此外，由于其独特的底物选择性，使之成为融合蛋白酶切的首选工具酶，并被广泛应用于重组蛋白表达，蛋白质分析等方面。尤其在生物制药领域，相当数量的重组蛋白类药物都是通过融合表达的方式进行生产，因此需要在下游的工艺中切除融合蛋白标签，以避免严重的毒副反应。完整的肠激酶由两条肽链组成，其中重链与其识别胰蛋白酶原相关，而轻链则因包含催化活性中心，被克隆表达以作为重组蛋白药物生产的辅助工具。来源于人的肠激酶是目前已知活性最高的肠激酶，比目前最常使用的牛肠激酶高出约10倍，非常适用于制备高效的固化酶切系统。但是重组人肠激酶轻链在制备过程中，由于其极低的复性得率，阻碍了其大规模应用。另一方面，同其他哺乳动物来源的肠激酶相似，重组人肠激酶轻链有时也会水解非特异性氨基酸位点的肽键，致使目的蛋白的得率降低，并产生副产物。非特异性活性的存在，也影响了重组人肠激酶的应用范围。本课题通过蛋白结构分析各氨基酸的二面角和立体空间位置，并辅助以分子动力学模拟技术，寻找最合适的改造位点，并利用定点突变技术将其突变成为构象熵值最高的脯氨酸，在提高热稳定性的同时，减少复性过程中无活性聚体的产生，从而提高重组人肠激酶轻链的复性得率。另一方面，通过解析特异性远高于其它同类酶的鳉鱼肠激酶的晶体结构，通过对比分析其与人、牛肠激酶轻链的结构上的差异，寻找与特异性相关的氨基酸位点。并在此基础上，再次利用定点突变技术，对重组人肠激酶进行改造，提高其特异性。结果表明，重组人肠激酶轻链的62位赖氨酸和101位的赖氨酸在突变为脯氨酸后，可以在增强热稳定性的同时，明显提高蛋白酶的复性得率（10倍）。另一方面，在解析了鳉鱼肠激酶轻链的晶体结构并结合突变研究后，发现24位组氨酸和185位甘氨酸之间，以及136位谷氨酸和213位精氨酸之间的相互作用，对于其高特异性有很大贡献。在此基础上，将重组人肠激酶轻链中的24位亮氨酸、136位酪氨酸和213位亮氨酸分别突变为鳉鱼肠激酶轻链中对应的的组氨酸、谷氨酸和精氨酸，发现24位的突变可以提高人肠激酶轻链的特异性，而136位的氨基酸残基对肠激酶的活性影响巨大。本研究首次证明，利用结构分析与分子模拟软件可以在蛋白质中找到合适的位点，通过定点突变引入脯氨酸残基，以帮助蛋白质的复性折叠，显著提高复性得率。此外，本研究首次解析了鱂鱼肠激酶轻链的晶体结构，并发现肠激酶轻链中活性中心附近的24位组氨酸和185位甘氨酸之间，以及136位谷氨酸和213位精氨酸之间可以相互作用，是其高特异性的结构基础之一。其中，24位的组氨酸可以“移植”到人肠激酶轻链中，以提高酶的特异性。最终，本研究开发出了高特异性高复性得率以及高稳定性的重组人肠激酶轻链，为其大规模应用于融合蛋白的酶切打下了坚实的基础。