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目的:帕金森病是最常见的神经退行性疾病之一,典型病理改变包括黑质致密部多巴胺能神经元进行性缺失、神经元α-突触共核蛋白沉积以及胞浆内路易小体形成。目前,帕金森病的发病机制仍不明确。现有的治疗药物并不能缓解或减少多巴胺能神经元的丢失,也不能遏制疾病的进展。因此,开发具有抑制多巴胺神经元死亡或促进神经元生成功能的生物活性物质已成为当今帕金森病研究的热点。自噬-溶酶体途径是真核细胞特有的由基因决定并调控的生命过程,是继泛素-蛋白酶体系统外另一类降解细胞内蛋白质的系统。自噬过程可以分为以下几部分:自噬诱导、自噬囊泡延伸、自噬体成熟以及与溶酶体结合并降解底物。多项研究表明在帕金森病中自噬-溶酶体途径存在异常,如何调控自噬-溶酶体途径改善神经细胞活性对开发帕金森病治疗手段至关重要。ghrelin是主要由胃黏膜X/A样细胞在接受饥饿信号刺激后分泌的一种脑肠肽,它可以通过血脑屏障到达中枢系统的不同结构发挥多种生物学功能。血浆中的ghrelin主要以辛酰化(Acylated ghrelin,AG)和未辛酰化(Unacylated ghrelin,UAG)两种形式存在。目前,在帕金森病领域,UAG是否有神经保护作用尚存在争议,而AG在多种中枢神经系统疾病模型中均被证实具有神经保护作用,故而在本部分研究中我们重点关注AG神经保护作用的潜在机制。目前研究证实AG可以通过抗炎、抗氧化应激、抗凋亡等多个途径在帕金森病模型中发挥神经保护作用,而ghrelin如何调控自噬-溶酶体途径以及该效应在其神经保护作用中的意义尚不明确。在本研究中,我们将应用6-OHDA诱导帕金森病大鼠及SH-SY5Y细胞模型,分别从自噬活化、自噬流状态以及溶酶体降解等角度明确6-OHDA对自噬-溶酶体的调控作用以及对于神经细胞活性的影响;在明确以上问题的基础上,我们进一步应用动物及细胞模型明确ghrelin对自噬-溶酶体途径的调控作用,并初步探讨其潜在分子机制。研究方法:本研究首先在6-OHDA诱导帕金森大鼠模型中运用免疫荧光、Western blot等方法对自噬相关蛋白进行检测,以明确6-OHDA对多巴胺能神经元自噬活化的影响,并应用自噬抑制剂以及半胱氨酸蛋白酶抑制剂明确自噬活化对该模型中神经细胞凋亡以及远期多巴胺能神经元存活的影响。在此基础上,我们进一步应用6-OHDA诱导帕金森大鼠及SH-SY5Y细胞模型,用氯喹干预和Ad-mCherry-GFP-LC3B腺病毒感染的方法分别明确在体和离体模型中自噬流的状态,并通过检测溶酶体表面相关蛋白表达以及溶酶体内水解酶功能进一步明确本帕金森病模型中溶酶体的表达水平及功能状态。此后,通过质粒转染增加相关蛋白表达及抑制剂或小干扰RNA抑制相关蛋白表达双向调控自噬流,明确自噬流状态对本模型中神经细胞活性的影响。在明确自噬-溶酶体途径在6-OHDA诱导帕金森病中的功能及意义后,我们分别于动物及细胞模型中给予ghrelin处理,验证其神经保护作用,并应用免疫荧光、Western blot等方法明确ghrelin对自噬的调控作用。此后分别给予自噬不同阶段的抑制剂,进一步明确ghrelin对自噬-溶酶体途径的调控靶点,并初步探索其潜在机制。结果:1、6-OHDA诱导帕金森病大鼠模型在处理后1天内即可观察到自噬与凋亡相关蛋白表达显著增高,而用3-MA阻断自噬活化及Z-FA-fmk抑制半胱氨酸蛋白酶均可减少6-OHDA诱导自噬体形成数量,并可显著下调6-OHDA诱导凋亡相关蛋白的高表达;此外,二者预处理后1周后检测多巴胺能神经元数量发现3-MA及Z-FA-fmk均可保留更多多巴胺能神经元,并显著改善大鼠行为学状态,提示抑制早期6-OHDA诱导自噬体形成具有远期神经保护作用。2、6-OHDA诱导帕金森病大鼠模型于处理后1周神经元丢失约50%左右,而其诱导自噬与凋亡蛋白高表达多发生于6-OHDA处理后1周内,并于第5周可观察到p62显著高于正常水平(P<0.05),提示自噬流存在异常;在6-OHDA处理1周后,在体腹腔注射氯喹阻断自噬体与溶酶体结合,发现氯喹处理并不能进一步上调黑质内LC3-II或p62蛋白水平,且Ad-mCherry-GFP-LC3B腺病毒感染SH-SY5Y细胞后给予6-OHDA处理24h后可见细胞内出现大量黄色荧光斑点,提示自噬体降解受阻,上述结果共同提示6-OHDA诱导帕金森病模型中自噬流存在障碍。通过对溶酶体表面相关蛋白表达水平进行检测以及对SH-SY5Y细胞内功能性溶酶体染色发现6-OHDA可以显著减少溶酶体数量;通过检测溶酶体内组织蛋白酶B及组织蛋白酶D活性发现6-OHDA可以在不同程度损伤二者活性。通过用Western blot及免疫荧光方法进一步对调控溶酶体表达的转录因子EB(TFEB)的表达水平及分布进行检测发现6-OHDA处理后TFEB总蛋白及核蛋白表达水平均显著降低,而质粒过表达TFEB可以改善6-OHDA所致LAMP1mRNA水平减低,并减轻6-OHDA所致细胞凋亡。此外,用3-MA抑制自噬体形成或小干扰RNA削弱自噬相关蛋白Atg7表达也可在不同程度减轻6-OHDA所致细胞凋亡。3、ghrelin可以改善6-OHDA所致SH-SY5Y细胞活性降低并上调6-OHDA所致黑质部TH水平降低,并与其作用剂量密切相关,过高剂量ghrelin反而会削弱其神经保护作用甚至加重神经损伤。此外,ghrelin处理可显著上调自噬相关蛋白,在此基础上用3-MA及氯喹分别抑制自噬起始环节及自噬体与溶酶体结合环节发现氯喹可明显增加黑质致密部内凋亡相关蛋白表达水平而3-MA对ghrelin的凋亡抑制效应无显著影响。用Ad-m Cherry-GFP-LC3B腺病毒感染SH-SY5Y细胞发现ghrelin预处理后再给予6-OHDA处理,SH-SY5Y内可观察到红色荧光强度增高而黄色荧光斑点数量明显减少,提示ghrelin可显著改善6-OHDA所致自噬流障碍。免疫荧光检测ghrelin对SH-SY5Y细胞内TFEB表达及分布的影响发现6-OHDA处理后的SH-SY5Y细胞中,ghrelin不但可以增加细胞内TFEB总荧光强度,而且细胞核内TFEB荧光强度也有所增加。结论:1、6-OHDA处理后早期即可同步激活自噬与凋亡,而抑制自噬早期活化不但可以减轻6-OHDA所致细胞凋亡并具有长效神经保护作用;2、6-OHDA可导致自噬流障碍,该效应与6-OHDA负向调控TFEB表达及核易位情况,损伤溶酶体数量及功能密切相关,而通过抑制自噬体形成或TFEB过表达促进溶酶体生成双向调控自噬流均可减轻6-OHDA所致神经细胞凋亡;3、ghrelin在6-OHDA诱导帕金森病大鼠及细胞模型中均具有神经保护作用且该效应取决于其作用浓度,其作用机制与其缓解6-OHDA所致自噬流障碍密切相关,而ghrelin可促进TFEB的表达及核易位可能是其对自噬流调控的潜在机制。