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目的:孕马结合雌激素(conjugated estrogens,CE)是雌激素补充疗法中使用最为广泛的药物,对于骨质疏松、心血管疾病及改善妇女绝经期症状有良好的治疗和预防效果。新疆伊犁地区是全国马匹最为集中的地区,在充分利用当地优势资源开发孕马结合雌激素新药的产业化进程中,有诸多关键技术需要解决。针对这些问题本课题进行了以下研究:1)建立孕马尿原料品质评价新方法,有望解决在孕马尿收购过程中快速检测的难题;2)建立新疆孕马CE原料药HPLC-UV指纹图谱、LC-MS及GC-MS药学等效性评价方法,进行新疆孕马CE原料药与美国同类产品Premarin的药学等效性(Pharmaceutical Equivalence)评价,为新疆孕马CE原料药进行国际认证提供依据;3)对新疆孕马CE原料药中未知成分的化学结构进行分析,为进一步揭示和证实孕马CE的多靶点综合作用的物质基础提供依据。方法:1.孕马尿原料品质评价研究采用自制HPD-400大孔吸附树脂固相萃取小柱对孕马尿样品进行前处理,利用5%NaCl溶液及1.5%NaOH溶液除去孕马尿中干扰杂质,无水乙醇进行洗脱,利用乙酸乙酯-二氯甲烷-甲醇(30:90:22)作为展开剂,利用硅胶板和银化硅胶板对孕马尿中雌酮硫酸钠(ES)、马烯雌酮硫酸钠(EqS)和17α-双氢马烯雌酮硫酸钠(17α-EqS)等主要结合雌激素进行分离,采用20%的硫酸乙醇溶液作为显色剂,进行新疆孕马尿中主要CE定性研究。采用HPD-400大孔吸附树脂固相萃取进行孕马尿前处理,采用高效液相色谱法(HPLC)、超高效液相色谱法(UPLC)及液相色谱-质谱联用法(LC-MS)三种检测方法对孕马尿中3种主要CE进行含量测定,建立了孕马尿中3种主要CE含量的HPLC、UPLC及LC-MS测定方法,考察了三种方法的精密度和准确度,以寻找快速检测孕马尿中主要CE含量的方法。2.新疆孕马结合雌激素原料药质量评价方法研究1)新疆孕马CE原料药HPLC-UV指纹图谱质量评价方法研究采用0.025mol/L磷酸二氢钾溶液和乙腈为流动相,梯度洗脱,Agilent Zorbax ODS柱(4.6mm×250mm、5μm)为分析柱,检测波长215nm,考察了 10批新疆孕马CE原料药与3批美国同类产品Premarin的HPLC-UV指纹图谱中共有峰的个数、相对保留时间及相对峰面积等指标。2)新疆孕马CE原料药与美国同类产品Premarin的LC-MS药学等效性评价根据美国FDA的工业指南提供的LC-MS药学等效性评价方法,对10批新疆孕马CE原料药与3批Premarin在LC-MS药学等效性条件下的56个m/z的提取离子色谱进行考察,以相对峰面积>0.1%及>1%的碎片离子数目进行分析,对新疆孕马CE原料药与美国同类产品Premarin进行药学等效性一致性评价。3)新疆孕马CE原料药GC-MS药学等效性评价研究采用硫酸酯酶水解孕马CE原料药,采用1%三甲基氯硅烷的二(三甲基硅烷)三氟乙酰胺进行衍生化,以恒压模式进行分析,15m的DB-225毛细管色谱柱进行分离,质谱条件:EI源,离子源温度:200℃,倍增器电压:1kv,质谱库:NIST。建立了新疆孕马CE原料药GC-MS指纹图谱,在GC-MS指纹图谱基础上建立了新疆孕马CE原料药GC-MS药学等效性评价方法,以共有峰的个数、相对保留时间、特征离子碎片及及相对峰面积,作为评价指标,并与Premarin进行GC-MS药学等效性评价。3.新疆孕马结合雌激素原料药中未知成分的化学结构质谱分析在GC-MS药学等效性实验的基础上,利用GC-MS方法中MS的定性功能,通过组分的电子轰击源(EI)及化学电离源(CI)得到的碎片离子特征图谱,结合EI源裂解规律及标准图谱的信息,对新疆孕马CE原料药中GC-MS指纹图谱中40个共有峰对应的化合物进行结构分析,并采用对照品对鉴定的化合物的结构进行确证。结果:1.孕马尿品质评价研究经HPD-400大孔吸附树脂固相萃取小柱前处理后的样品进行薄层色谱定性分析,供试品与对照品在相应位置显相同颜色的条带,条带清晰,分离效果好,阴性无干扰。银化硅胶G板能有效分离雌酮硫酸钠、马烯雌酮硫酸钠及17α-双氢马烯雌酮硫酸钠。建立的HPLC、UPLC及LC-MS含量测定方法的准确度和精密度均能符合检测要求。UPLC和LC-MS方法较HPLC方法能大大缩短样品测定周期,并通过6批孕马尿样品测定结果的统计方法比较,结果显示三种方法的测定结果无统计学意义。2.新疆孕马结合雌激素原料药质量评价方法研究建立的HPLC-UV指纹图谱法表明10批新疆孕马CE原料药的一致性很好,检测出新疆孕马CE原料药中相对峰面积>0.1%的27个共有峰,得到分离度和重现性较好的CE原料药HPLC-UV指纹图谱,利用建立的HPLC-UV指纹图谱评价指标分析3批Premarin的HPLC-UV指纹图谱情况,结果显示:新疆孕马CE原料药与Premarin的成分一致性较好,新疆孕马CE原料药在58min处多出一个峰。新疆孕马CE原料药的LC-MS药学等效性实验结果显示:有56个m/z提取离子图谱(EIC)中可观察到明显的峰;其中50-54个m/z的EIC图谱检测到离子峰的峰面积>0.1%,相对峰面积在0.1%以上的峰数平均为230个,m/z个数平均52个,19～23个m/z的EIC图谱检测到离子峰的峰面积>1%,峰数平均为42个,m/z个数平均为21个,新疆孕马CE原料药与Premarin药学等效性实验结果基本一致,符合FDA工业指南的要求。建立的GC-MS药学等效性评价方法可以检测出新疆孕马CE原料药中相对峰面积>0.1%的40个共有峰,通过对10批新疆孕马CE原料药和3批Premarin的GC-MS药学等效性考察,结果显示:新疆孕马CE原料药中有4个小峰略有差异,其余共有峰与美国同类产品Premarin一致性很好。3.新疆孕马结合雌激素原料药中未知成分的化学结构质谱分析通过新疆孕马CE原料药的GC-MS色谱峰的EI-MS及CI-MS的碎片离子信息,对新疆孕马CE原料药与Premarin有差异的4种成分进行了 MS解析,确定其化学结构分别为3-羟基-孕甾-16-脱氢-20-酮、3-羟基-1,3,5(10)-甾三烯-6,17-二酮、3-羟基-16-甲氧基-孕甾-20-酮及3-羟基-1,3,5(10)-雌甾三烯-17-酮。通过与对照品验证,证明了质谱推断的正确;通过LC-MS信息,确定了其中2种在原料药中是以硫酸钠盐形式存在、1种是以游离态形式存在。通过标准图谱检索得到18种共有组分的结构信息;10种共有成分的化学结构通过质谱分析得到其结构。组分的质谱分析表明:新疆孕马结合雌激素原料药中39(不含内标峰)共有峰中雌激素为14种,孕激素5种,雄激素10种,脂肪酸酯2种,8个较小面积的色谱峰对应的化合物未能鉴定。结论:1.本文所建立的孕马尿大孔树脂固相萃取前处理方法,快速、成本低、除杂效果好,可作为孕马尿中主要CE定性、定量检测的前处理方法。银化硅胶薄层法可作为3种主要CE的快速定性方法。UPLC及LC-MS法可作为孕马尿中3种主要CE的快速定量检测方法。2.新疆孕马CE原料药的HPLC-UV指纹图谱、LC-MS及GC-MS药学等效性实验的建立为新疆孕马CE原料药的质量评价提供重要方法,在上述三种方法下进行新疆孕马CE原料药与Premarin的质量评价,结果显示新疆孕马CE原料药与Premarin在成分组成上极为相似,证明新疆孕马CE原料药与Premarin具有药学等效性。3.通过对新疆孕马CE原料药和Premarin的GC-MS指纹图谱分析,采用质谱分析方法鉴定了新疆孕马CE原料药中含量较大的32种成分的化学结构,其中11种成分为目前已报道的CE(包括内标),其余21种均为首次通过质谱分析确定化学结构的,这些成分化学结构的确定,为进一步揭示和证实了孕马CE的多靶点综合作用的物质基础。