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A型流感病毒可以引起人类严重的呼吸道疾病，也是禽、马、猪、貂、海豹及鲸的病原。A型流感病毒拥有众多的亚型，病毒本身也在不断地发生变异和重组。2013年中国爆发的人感染新型重组A型H7N9流感病毒，截止2016年12月通过《国际卫生条例》报告，迄今共发生了807例人感染确诊病例。流感的爆发给人类安全健康带来严重的危害，也给养殖业带来重大的经济损失。A型流感病毒的复制周期短，在病毒复制过程中，M2蛋白对于病毒脱壳、组装和释放均发挥着重要的作用。虽然M2蛋白较为保守，但不同亚型的M2蛋白抗原表位也有所不同。因此需要可以识别多个亚型M2蛋白的单克隆抗体，以便于不同流感亚型M2的研究。为了获得可以识别多个A型流感病毒亚型M2蛋白的通用型单克隆抗体，进行以下实验。 根据实验室保存的A型流感病毒H3N2毒株序列，设计特异性引物，扩增H3N2M2基因，再通过融合PCR扩增出缺失跨膜区的M2基因(sM2)。将扩增的sM2目的片段构建到pGEX-4T-1原核表达载体上，转化至BL21(Plyss)表达菌种上，经IPTG诱导成功大量表达融合蛋白GST-sM2，分子量大小37Ku。最后融合蛋白通过GST-Resin交联琼脂糖微球进行非变性纯化，获得纯度较高的GST-sM2重组蛋白。与此同时，根据H3N2M2氨基酸序列人工合成4条较为保守且可能具有抗原表位的多肽6-12、19-26、36-51和62-77，运用双功能试剂Sulfo-SMCC将四条多肽分别偶联至BSA载体蛋白上，形成人工的合成抗原多肽BSA-Pep。最后以纯化的GST-sM2和抗原多肽BSA-Pep分别免疫小鼠，分别取脾细胞与SP2/0进行细胞融合，经ELISA、IFA和Dot Blot的筛选一共获得8株阳性单克隆抗体。其中由GST-sM2免疫小鼠筛选而来的5株单克隆抗体命名为10D9、10F4、8F4、6F2和6C1;由抗原多肽BSA-Pep免疫小鼠筛选而来的3株单克隆抗体命名为1E2、4B5和5G10。 为了初步确定单抗的抗原表位，将M2截短体（1～26aa和50～97aa）分别克隆至真核表达载体pGEFP-C3上，转染293T细胞，以单抗为一抗进行孵育，IFA检测结果表明10F4单抗抗原表位位于N端1～26aa内，而另外7株单抗的抗原表位则位于C端50～97aa内。在初步确定抗原表位后，利用偶联的抗原多肽BSA-Pep，采用Peptide-ELISA和Peptide-Dot Blot实验方法结果一致显示10F4的抗原表位位于N端6～12aa内，而10D9、1E2、4B5和5G10的抗原表位则位于C端62～77aa内，但是6C1和6F2未能进一步确定其抗原表位。 为鉴定单抗的通用型，将8株M2蛋白单克隆抗体分别与A型流感病毒H1N1、H3N2、H5N1、H7N9和H9N25个亚型进行Western Blot和IFA的反应性鉴定。鉴定结果显示10D9单抗与5个亚型的M2蛋白均能特异性结合，而另外7株单抗则只能与1个或多个亚型反应。为了验证10D9单抗的特性，以10D9单抗为一抗分别与H1～H1313种A型流感病毒亚型M2蛋白进行Western Blot和IFA的反应性实验。结果表明，10D9单抗能与所有亚型的A型流感病毒M2蛋白反应，且反应性良好。10D9也能与同一亚型的不同毒株反应。与PR8、H3N2、PiKa、H7N9、H9N2、GST-sM2和Myc-M2蛋白免疫共沉淀结果显示，10D9能钓出不同来源的M2蛋白。以10D9抗体进行中和试验时，发现10D9不具有抑制病毒复制的能力。10D9单抗分别对病毒感染和真核转染的M2蛋白进行细胞亚定位分析，激光共聚焦显示感染和转染的M2蛋白都主要定位在细胞膜上。对小鼠感染H7N99d和14d取肺脏组织，送往公司制作切片10D9可以作为免疫组化的抗体结合到小鼠肺组织中的病毒上。以上结果表明，10D9抗体不仅具有良好的M2特异性识别，而且还能广泛应用于不同亚型的A型流感病毒的各种实验，具有抗M2蛋白通用性抗体的特性，对于M2蛋白的检测与深入研究都具有重要意义。