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研究背景胰腺癌是临床上难治性恶性肿瘤之一,其发病率有逐年上升的趋势。外科手术是现阶段胰腺癌最为有效的治疗方式,但术后容易复发和转移,而且70%-90%的病人确诊时已丧失根治手术的时机,5年生存率依然小于5%。因此,积极寻求新的治疗措施,提高胰腺癌的综合治疗水平是亟待解决的重要课题。随着分子生物学、免疫学对肿瘤发生、发展和转移机制研究的不断深入和交叉渗透,以免疫学原理为基础、分子生物学技术为方法建立起来的肿瘤免疫基因治疗(Immunogene therapy)为胰腺癌的治疗提供了新的希望。然而现已报道的大多数肿瘤临床基因治疗方案中,绝大多数方案采用单一抗肿瘤的目的基因,而单基因治疗肿瘤疗效大多不甚理想,局限性大,相比之下,多基因联合治疗具有更大的合理性与优越性,是肿瘤基因治疗发展的必然方向。肿瘤发生及演进是涉及多基因的复杂过程,而单一抗肿瘤基因作用不强大且有限,往往难以有效抑制肿瘤细胞增殖。因此,利用两种或多种基因联合治疗肿瘤,可充分发挥抗肿瘤基因间相互协同作用,显著增强抗肿瘤基因治疗的效果。NK4是1997年Date等[1]用胰弹性蛋白酶消化裂解重组人肝细胞生长因子(Hepatocyte Growth Factor, HGF)时发现的一种HGF特异性拮抗剂,它由HGFα链N末端的447个氨基酸和4个Kringle区域所组成。HGF又称分散因子(Scatter Factor, SF),是来源于间质细胞的多功能细胞因子,在肿瘤细胞的粘附、基质降解、侵袭及转移过程中起重要的作用。HGF通过激活其特异性受体c-Met,从而促进多种肿瘤细胞的运动、侵袭、基质的降解和诱导新生血管形成,导致肿瘤的发生和转移。研究表明HGF/c-Met信号转导途径与胰腺癌细胞的恶性度有关,胰腺癌细胞有c-Met的过度表达,而胰腺癌组织中的成纤维细胞则通过旁分泌的形式分泌HGF,诱导c-Met的酪氨酸磷酸化,刺激胰腺癌的生长、浸润和转移[2]。HGF通过其受体c-Met的激活,在调节肿瘤侵袭和转移以及血管形成中具有重要作用。因此NK4不仅是HGF的拮抗剂,也是血管生成的抑制剂。阻断HGF/c-Met途径和肿瘤血管生成可成为抗肿瘤治疗的策略之一[3]。Kushibiki等[4]研究发现转染NK4基能够改变恶性胰腺癌的生物学行为,抑制胰腺癌的生长、侵袭和转移。Murakami等[5]的实验在裸鼠模型上发现NK4能够抑制胰腺癌的肝转移,此外,研究还发现NK4是血管形成的抑制剂,可以抑制肝细胞生长因子、碱性成纤维细胞生长因子、血管内皮细胞生长因子所诱导的血管形成作用[6]。单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)是趋化因子超家族CC亚族中对单核细胞趋化活性最强的趋化因子,MCP-1在体内的抗肿瘤效应已经在一些动物实验中被证实。MCP-1能够通过T细胞依赖的和非T细胞依赖的方式来抑制肿瘤的生长[7]。Monti等[8]的研究发现MCP-1在胰腺癌的演进中起负性调节作用,他们发现胰腺癌患者MCP-1的水平明显高于正常人,而且血浆中MCP-1水平高的胰腺癌手术切除患者比水平低的患者有更好的预后。血浆MCP-1的浓度和肿瘤巨噬细胞的浸润呈正相关,而与肿瘤的增殖活动呈负相关。进一步的研究发现其机制是通过诱导单核巨噬细胞在肿瘤内浸润(intra-tumoral infiltration)来抑制肿瘤的生长和转移的。本课题以制备的分别携带NK4和MCP-1基因的两种重组腺病毒为基础,在体外条件下用两种重组腺病毒联合感染胰腺癌细胞SW1990,使NK4基因及MCP-1基因在胰腺癌细胞内表达并分泌NK4和MCP-1蛋白,探讨联合NK4和MCP-1基因治疗胰腺癌的可行性及可能机制,为进一步临床应用联合NK4和MCP-1基因治疗胰腺癌奠定基础目的扩增、纯化重组NK4及重组MCP-1腺病毒,在体外条件下联合两种重组腺病毒感染胰腺癌细胞SW1990,将NK4基因及MCP-1基因导入胰腺癌细胞,使其表达并分泌NK4和MCP-1蛋白。检测基因表达对肿瘤细胞和血管内皮细胞的影响探讨联合NK4和MCP-1基因治疗胰腺癌的可行性及可能机制。为进一步临床应用联合NK4和MCP-1基因治疗胰腺癌奠定基础。方法1.将NK4及MCP-1重组腺病毒分别感染HEK293包装细胞制备重组腺病毒,纯化并通过GFP法测定病毒的滴度。2.用不同MOI的重组腺病毒悬液感染人胰腺癌SW1990细胞,判断不同滴度腺病毒对胰腺癌细胞的感染效率。3.以合适滴度的重组NK4与MCP-1腺病毒颗粒分别及联合感染SW1990胰腺癌细胞,荧光定量RT-PCR检测病毒感染SW1990胰腺癌细胞后NK4基因和MCP-1基因的mRNA表达水平;4.应用ELISA检测病毒感染SW1990胰腺癌细胞后MCP-1蛋白的表达5. MTT确定NK4联合MCP-1重组腺病毒的感染对SW1990细胞和血管内皮细胞生长的影响。结果一定浓度的Ad-Track、Ad-NK4、Ad-MCP-1能够100%感染HEK293细胞并在细胞内成功扩增。当采用的MOI小于80 efu/细胞时,腺病毒对SW1990细胞的感染效率随病毒滴度的增加而提高。MOI为60 efu/细胞时,SW1990细胞的感染效率接近100%。荧光定量RT-PCR检测基因mRNA的表达,以病毒感染24小时基因表达水平为100%,MCP-1及NK4的表达在第5天达到最高,分别为24小时表达量的7.46倍和7.57倍随后开始下降,第9天的表达水平只有24小时表达量的1.6倍左右。到12天时基因的表达水平只剩下约1/4。MCP-1及NK4两种病毒联合感染SW1990细胞,每个基因的表达水平比单一感染时下降约30%。病毒感染后连续6天绘制SW1990细胞的生长曲线,三种感染模式下的细胞生长曲线与对照的母细胞没有显著差异;单一重组NK4腺病毒单独及联合重组MCP-1腺病毒感染SW1990细胞后的上清对血管内皮细胞的生长都有抑制作用。结论腺病毒介导的Ad-NK4、Ad-MCP-1能有效地感染SW1990细胞并表达高水平的NK4和MCP-1基因并能有效分泌到细胞外,峰值维持在3-7天左右。腺病毒感染介导的NK4及MCP-1基因的表及达在体外对SW1990生长无明显影响。但Ad-NK4感染胰腺癌细胞后表达的NK4明显抑制了HGF刺激的血管内皮细胞的生长,说明在胰腺癌中NK4可能主要通过抑制肿瘤血管的生成发挥抑瘤的作用。MCP-1主要是通过免疫机制发挥抗肿瘤作用,体外实验观察不到其对胰腺癌细胞生长的影响是与其生物学功能一致的。通过腺病毒感染胰腺癌细胞的体外实验,确定了两种病毒感染后基因表达的有效性和时效性,同时初步证实了NK4发挥抑制胰腺癌作用的可能机理。从MCP-1及NK4基因的功能看,要想确定其联合治疗对胰腺癌的抑瘤作用及及理论,必须以胰腺癌的动物模型为基础进行观察和分析,相关试验正在进行中。