论文部分内容阅读
抑制素是一种主要由性腺分泌的糖蛋白激素,对FSH起负反馈调节作用。抑制素DNA疫苗可以产生抑制素抗体,促进FSH的分泌,促进卵泡发育,诱发排双卵。近年来其作为多胎疫苗的角色已越来越为人们所重视。为了增强抑制素DNA疫苗的体液免疫,以中和内源的抑制素,本研究论文就抑制素抗原表位,抑制素DNA疫苗的构建,免疫后对卵泡发育、生殖激素的影响等几个方面进行了初步研究。(1)应用I-TASSER 3D结构模拟分析法对猪INHα进行结构建模和基于不同参数的B细胞抗原表位预测,然后对INHα分别用Psipred、PredictProtein分析二级结构,氨基酸Kyte-Doolittle方案分析亲水性、Emini方案分析表面可及性、Jameson-Wolf方案分析抗原指数。最后对不同方法分析的结果进行比较,综合对猪INHα进行进行B细胞抗原表位预测,猪抑制素α亚基具有的优势B细胞抗原表位位于N端1～30、43～51、61～75、87～100、105～125氨基酸区段。(2)采用PCR方法扩增INHα(1～32)基因片段,插入克隆载体pMD18,然后亚克隆至真核表达载体pcDNA-DPPISS ,构建含有双拷贝INHα( 1～32 )基因的真核表达载体pcDNA-DPPISS-DINH,鼠源C3d3应用限制性内切酶从载体pSG5.C3d3.YL切下后,克隆入pcDNA-DPPISS-DINH,构建DINH-C3d3融合的抑制素基因疫苗pcDNA-DPPISS-DINH-C3d3。结果:酶切及测序结果显示,pcDNA-DPPISS-DINH、pcDNA-DPPISS-DINH-C3d3构建正确;结论:本实验构建的抑制素基因疫苗pcDNA-DPPISS-DINH、pcDNA-DPPISS-DINH-C3d3,这为进一步的动物实验打下了基础。(3)选择48只60日龄雌性性成熟大鼠分为6组,分别肌肉注射pcDNA-DPPISS-DINH(试验组1) 50ug, pcDNA-DPPISS-DINH-C3d3 (试验组2) 50ug,,pcDNA-DPPISS-INH (试验组3) 50ug, pcDNA-DPPISS-INH-C3d3 (试验组4),50ug空载体pcDNA3.1 (对照组1) 50ug,生理盐水(对照组2)1ml。间隔20 d、40天后用重组基因质粒加强免疫2次。结果发现,试验组卵巢的重量都显著高于对照组1和2,但试验1和2组之间的差异不显著(P>0.05)。试验2组卵巢成熟卵泡发育个数极显著多于试验1组和对照1和2组(P<0.01);试验2组卵巢成熟卵泡发育个数显著多于试验1组和试验3,4组(P<0.05);加强免疫第40天,试验1和2组的FSH、E2的浓度分别显著高于本试验组免疫前第0天,免疫后第20天的激素浓度。试验组与对照组在各个免疫试验时间LH的浓度在统计上差异不显著(P>0.05)。本试验结果证明,应用重组串联抑制素真核表达质粒pcDNA-DPPISS-DINH-C3d3免疫动物可以促进大鼠卵泡的发育,可提高血浆FSH, E2水平。(4)从绵羊(Ovis aries)肝脏组织克隆到了补体C3d基因并对其核苷酸序列和推导的氨基酸序列以及蛋白结构进行了分析。绵羊补体C3d基因的编码区含有909个核苷酸,编码303个氨基酸残基(GenBank登录号为:EF681138),绵羊与人、牛、山羊、野猪、金仓鼠、小鼠、褐鼠、大袋鼠、兔和原鸡推导出的氨基酸序列的一致性分别为80.4% ,94.7% ,96.9%,82.8%,81.1%,80.6% ,80.2%,71.0% ,75.2%和60.3%。高等动物中,绵羊与原鸡的一致性最低为60.3%,而与其它动物之间的一致性则较高为71.0%～96.9%。生物学软件分析发现绵羊C3d蛋白有2个蛋白激酶C磷酸化位点,1个酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位点,1个酪氨酸激酶磷酸化位点,1个十四(烷)酰化位点。绵羊C3d二级结构中螺旋和转角交替出现,其中α螺旋占55.12%、β折叠为2.31%,转角区域为42.57%,这样的结构有利于其桶状结构的形成。ESyPred3D同源建模预测可知绵羊C3d三级结构与人C3d一样也形成由核心和外层构成的桶状分子结构。(5)采用RT-PCR技术扩增绵羊补体C3d基因片段,将该片段插入到pMD18-T载体,然后亚克隆至真核表达载体pcDNA-DPPISS-DINH-mC3d3构建pcDNA-DPPISS-DINH-sC3d3。pcDNA-DPPISS-DINH-sC3d3脂质体法转染BHK-21细胞, Western blotting鉴定DINH-sC3d3融合蛋白。结果:酶切及测序结果显示, pcDNA-DPPISS-DINH-sC3d3构建正确;在BHK-21细胞中成功地获得了DINH-sC3d3融合蛋白的高效表达。本实验构建的抑制素基因疫苗可在真核细胞内正确表达,这为进一步的动物实验打下了基础。