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晚疫病是马铃薯生产中最为严重的病害,每年都造成巨大的经济损失。为了研究马铃薯晚疫病抗病机理,实验室前期从马铃薯中克隆了一个乙烯应答因子基因StERF3,该基因能够被SA、MJ和ETH显著诱导表达。序列分析发现StERF3的C-末端存在-L/FDLNL/F(x)p motif,即EAR基序。初步研究显示,该基因在晚疫病抗性中可能起到负调控作用。其作用机理有待进一步深入研究。
本课题StERF3基因的超量表达株系和干涉株系进一步做了抗性鉴定;通过构建启动子与GUS报告基因融合载体研究了启动子诱导表达特性;利用酵母双杂交技术筛选了与StERF3互作的蛋白,同时探讨了超量表达载体转基因株系中矮化植株的可能原因。获得的主要结果如下:1.利用RT-PCR对已获得的StERF3基因超量和干涉转基因株系基因表达量进行了检测,结果显示不同转基因株系表达量存在较大差异。选择超量表达和干涉沉默效果好的株系进行了接种鉴定。结果进一步确认,两个马铃薯品种E3和J超量表达株系的发病面积均大于对照,而E3和J特异干涉株系和非特异干涉株系发病面积均小于对照,表明StERF3基因在马铃薯晚疫病抗性中是负调控功能。2.用启动子预测软件预测StERF3基因启动子含有病原、SA、MJ、ETH、低温、盐胁迫等响应的顺式作用元件。构建了启动子和GUS报告基因的融合载体,经农杆菌介导转化法转化普通烟草和本氏烟草,共获得PCR鉴定为阳性的16株普通烟草和3株本氏烟草转基因植株。3株本氏烟草转基因株系叶片晚疫病诱导48 h进行GUS染色,烟草叶片呈现出不同程度的蓝色;普通烟草转基因植株进行SA、ETH、盐等非生物因素分别处理8 h、24 h、4 h后GUS染色,叶片也呈现出不同程度的蓝色,而用灭菌蒸馏水和10 mM乙醇处理的烟草叶片均不能染色。结果确证StERF3基因启动子是一个诱导型启动子,能够有效响应晚疫病、SA、ETH和盐胁迫的诱导,进一步表明StERF3基因在马铃薯抗病和抗逆中扮演重要角色。3.构建了酵母pGBKT7-StERF3诱饵载体,经检测无毒性和无自激活性;双杂交结果表明,在SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp/-X-a-gal平板上8 h内筛选出显深蓝色的有69个Ade+、His+斑。69个斑在SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp/X-β-gal平板上进行第二轮筛选,得到6个8 h内显蓝菌斑;测序和蛋白质序列比对发现6个蛋白中有一个全长序列与番茄CONSTANS interacting protein3蛋白具有很高同源性,主要与花发育相关;另外一个非全长序列编码氨基酸与蓖麻氰酸盐水合酶蛋白有较高同源性,蓖麻氰酸盐水合酶主要参与防御相关基因的表达。4.对转基因矮化株进行表型观察、表达量分析、组织切片分析、生长素互补试验。超量表达载体转化株系StERF3基因表达量都比对照低,这些矮化株系大多具有3-4个拷贝,超量表达载体多拷贝插入可能导致转基因沉默。干涉株系中StERF3基因表达量比对照明显下降,但是并未出现矮化现象。可见矮化与StERF3基因表达量关系可能无关。培养基中添加外源GA3能够在一定程度上提高矮化株生长量。转基因植株矮化的原因很可能是超量表达载体转化时由于多拷贝插入导致与GA3合成有关的基因失活或抑制所致。
本课题StERF3基因的超量表达株系和干涉株系进一步做了抗性鉴定;通过构建启动子与GUS报告基因融合载体研究了启动子诱导表达特性;利用酵母双杂交技术筛选了与StERF3互作的蛋白,同时探讨了超量表达载体转基因株系中矮化植株的可能原因。获得的主要结果如下:1.利用RT-PCR对已获得的StERF3基因超量和干涉转基因株系基因表达量进行了检测,结果显示不同转基因株系表达量存在较大差异。选择超量表达和干涉沉默效果好的株系进行了接种鉴定。结果进一步确认,两个马铃薯品种E3和J超量表达株系的发病面积均大于对照,而E3和J特异干涉株系和非特异干涉株系发病面积均小于对照,表明StERF3基因在马铃薯晚疫病抗性中是负调控功能。2.用启动子预测软件预测StERF3基因启动子含有病原、SA、MJ、ETH、低温、盐胁迫等响应的顺式作用元件。构建了启动子和GUS报告基因的融合载体,经农杆菌介导转化法转化普通烟草和本氏烟草,共获得PCR鉴定为阳性的16株普通烟草和3株本氏烟草转基因植株。3株本氏烟草转基因株系叶片晚疫病诱导48 h进行GUS染色,烟草叶片呈现出不同程度的蓝色;普通烟草转基因植株进行SA、ETH、盐等非生物因素分别处理8 h、24 h、4 h后GUS染色,叶片也呈现出不同程度的蓝色,而用灭菌蒸馏水和10 mM乙醇处理的烟草叶片均不能染色。结果确证StERF3基因启动子是一个诱导型启动子,能够有效响应晚疫病、SA、ETH和盐胁迫的诱导,进一步表明StERF3基因在马铃薯抗病和抗逆中扮演重要角色。3.构建了酵母pGBKT7-StERF3诱饵载体,经检测无毒性和无自激活性;双杂交结果表明,在SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp/-X-a-gal平板上8 h内筛选出显深蓝色的有69个Ade+、His+斑。69个斑在SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp/X-β-gal平板上进行第二轮筛选,得到6个8 h内显蓝菌斑;测序和蛋白质序列比对发现6个蛋白中有一个全长序列与番茄CONSTANS interacting protein3蛋白具有很高同源性,主要与花发育相关;另外一个非全长序列编码氨基酸与蓖麻氰酸盐水合酶蛋白有较高同源性,蓖麻氰酸盐水合酶主要参与防御相关基因的表达。4.对转基因矮化株进行表型观察、表达量分析、组织切片分析、生长素互补试验。超量表达载体转化株系StERF3基因表达量都比对照低,这些矮化株系大多具有3-4个拷贝,超量表达载体多拷贝插入可能导致转基因沉默。干涉株系中StERF3基因表达量比对照明显下降,但是并未出现矮化现象。可见矮化与StERF3基因表达量关系可能无关。培养基中添加外源GA3能够在一定程度上提高矮化株生长量。转基因植株矮化的原因很可能是超量表达载体转化时由于多拷贝插入导致与GA3合成有关的基因失活或抑制所致。