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奶牛乳房炎是影响中国乃至世界乳业发展的最重要的疾病之一,金黄色葡萄球菌、无乳链球菌、牛支原体和大肠杆菌等致病菌的感染是引起该病的最主要原因。本研究采用Chelex-100法从乳样中直接提取细菌DNA,分别检测了该法提取人工制备金黄色葡萄球菌、无乳链球菌、牛支原体或大肠杆菌乳样标本DNA进行PCR扩增的敏感性；选取金黄色葡萄球菌、无乳链球菌、牛支原体和大肠杆菌4种奶牛乳房炎主要致病菌的4对特异性引物,通过优化反应条件,建立可同时检测奶牛乳房炎4种主要致病菌的多重PCR方法；采用建立的多重PCR方法,检测临床采集的162份乳样,并与病原菌检测的“金标准”—培养法的结果进行比较。结果表明,Chelex-100法可经济、快速、有效地直接提取乳样细菌DNA,用于PCR检测奶牛乳房炎主要致病菌；建立的多重PCR方法可同时扩增奶牛乳房炎4种主要致病菌,具有良好的特异性和敏感性(检测无乳链球菌、牛支原体、大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的最小浓度分别为1.25x103、6.25x102、6.25x102、 1.25x103 CFU/mL);多重PCR法与培养法检测临床采集乳样的结果表明,2种方法检测金黄色葡萄球菌、无乳链球菌和大肠杆菌3种细菌的结果基本一致,差异不显著(P>0.05)；多重PCR法检测到的牛支原体乳样数多于培养法,差异极显著(P<0.01)。本研究建立的乳样中奶牛乳房炎4种主要致病菌的多重PCR检测方法,可以满足临床经济、快速、有效地检测奶牛乳房炎4种主要致病菌的需要,对临床防控奶牛乳房炎具有重要的意义。