柴胡以根入药,其根为常用大宗药材。柴胡根部主要药效成分为柴胡皂苷,具有抗炎、保肝、抗肿瘤等药理活性。不同品种柴胡根系结构差异显著,北柴胡根系结构表现为多支根、少支根及单支根,而狭叶柴胡根系表现为棕色根和白色根。药理成分研究表明不同根系结构柴胡药用成分含量差异显著。本研究以北柴胡(Bupleurum chineses DC.)新品种川北柴1号及狭叶柴胡(Bupleurum scorzonerifolium Willd.)新品种川红柴1号为试材,观测了侧根原基发育动态过程,添加了不同浓度生长调节物质后测定根系表型参数;克隆了参与柴胡侧根形成的基因,并分析调控基因在生长素处理时间梯度间的表达差异性。初步筛选出参与川北柴1号及川红柴1号侧根形成过程中的调控基因,为进一步探究功能基因奠定理论基础。研究结果如下:1.川北柴1号及川红柴1号侧根原基形成过程分析通过对川北柴1号和川红柴1号幼嫩主根纵向石蜡切片观测得出,川北柴1号侧根原基起源于靠近木质部中柱鞘细胞,部分内皮层细胞也参与侧根发育过程。侧根原基的发育可分为5个阶段:单细胞层阶段;2~3层侧根原基阶段;多细胞层侧根原基阶段;圆锥形侧根原基阶段;侧根原基突破表皮阶段。川红柴1号侧根原基发育过程与川北柴1号基本类似,但无内皮层细胞的参与。两种柴胡侧根发育过程比较表明,柴胡侧根发育过程既具有物种保守性,又具有物种特异性。2.生长调节物质对川北柴1号及川红柴1号侧根发育的影响不同浓度生长调节物质显著影响柴胡侧根发育。本研究表明,外施生长素和钙离子对柴胡根系发育起促进作用,而生长素抑制剂(TIBA)和钙离子螯合剂(EDTA)对柴胡根系发育起抑制作用。其中,10μmol/L生长素浓度极显著促进川北柴1号根系发育,0.01μmol/L生长素浓度极显著促进川红柴1号根系发育;10μmol/L钙离子极显著促进川北柴1号根系发育,1μmol/L钙离子极显著促进川红柴1号根系发育。此外低浓度(0.01μmol/L)生长素抑制剂TIBA促进川北柴1号根系发育,而对川红柴1号根系发育起抑制作用。钙离子螯合剂EDTA对柴胡根系发育主要起抑制作用。3.川红柴1号AUX/IAA、HO及LBD基因的克隆及测序分析选取生长素响应基因(auxin-responsive,AUX/IAA)、血红素加氧酶基因(heme oxygenase-1,HO)及侧根器官发育相关基因(Lateral organ Boundaries-Domain,LBD)共12个基因为候选基因进行PCR克隆及测序工作,除1个LBD基因因为引物问题未克隆成功外,其余基因均克隆测序成功。4.AUX/IAA、HO、LBD等基因在侧根形成过程中的表达特异分析选取生长调节物质试验中最适宜柴胡根系发育的生长素浓度,最适宜川北柴1号根系发育生长素浓度为10μmol/L,最适宜川红柴1号根系发育生长素浓度为0.01μmol/L。在施加生长素基础上进行时间梯度处理,实施荧光定量PCR技术实时监测基因表达量,SPSS软件数据统计处理后筛选出4个基因:IAA27-CH-c9124、IAA11-CH-c3456、HO-CH-c4076及HO-CH-c5308共同参与了川北柴1号和川红柴1号根系发育过程。5.调控基因生物信息学分析对初步筛选出参与柴胡根系发育的4个调控基因进行生物信息学分析。结果表明,川北柴1号和川红柴1号IAA27-CH-c9124基因碱基序列同源性为94.0%,基因编码的氨基酸均为碱性蛋白质,二级结构中α螺旋含量最高。序列分析分析表明IAA27-CH-c9124基因编码的蛋白质属于AUX/IAA超级家族且含有保守结构域IV,进化树聚类分析表明IAA27-CH-c9124基因与伞形科胡萝卜亲缘性最近。川北柴1号和川红柴1号IAA11-CH-c3456基因碱基序列同源性为95.0%,编码的氨基酸均为中性蛋白质,二级结构中β折叠含量最高。序列分析表明IAA11-CH-c3456基因属于AUX/IAA超级家族,且含有保守结构域的I,II,III。进化树聚类分析表明柴胡IAA11-CH-c3456基因与伞形科胡萝卜亲缘性最近。川北柴1号和川红柴1号中HO-CH-c5308碱基序列同源性为96.2%,HO-CH-c4076基因碱基序列同源性为96.7%,两种基因编码的氨基酸均为碱性蛋白质,二级结构中α螺旋含量最高。氨基酸保守结构域分析表明HO-CH-c5308基因不属于血红素加氧酶(HO)超级家族,而HO-CH-c4076基因属于血红素加氧酶(HO)超级家族基因。进化树聚类分析表明柴胡HO-CH-c5308基因与辣椒亲缘性最近,川北柴1号与川红柴1中HO-CH-c4076基因存在物种进化关系。