神经病理性疼痛在普通人群的罹患率在5%以上,目前还没有确切的病因治疗方法。神经病理性疼痛的发生,伴有痛觉传导通路不同部位基因表达的改变。微小RNA(microRNA或miRNA)是一种长度大约22个核苷酸的非编码RNA分子,生物体内每个微小RNA分子能够在转录后水平调节上百种不同基因的表达。神经病理性疼痛状态下脊髓背角被激活,同时它也是发生中枢敏化的重要部位。脊髓背角是外周痛觉向中枢传递的必经途径,在神经病理性疼痛状态下,脊髓传入纤维被激活,释放神经递质和神经肽,这些物质能够诱发脊髓背角的多种神经病理性疼痛相关病理过程及脊髓内局部神经回路的变异和重塑。结果导致了当初的伤害性传入信号在向中枢传递过程中被放大并持续,即为中枢敏化。本研究的主要目的是检测神经病理性疼痛大鼠,痛觉传导通路不同部位微小RNA的表达谱,及差异表达微小RNA的靶基因预测和验证。研究目的：1.神经病理性疼痛痛觉传导系统不同部位,miRNA可能的表达谱；2.筛选脊髓差异表达最明显的miRNA分子,对其进行生物信息学靶预测；找出疼痛相关的靶基因；3.在神经病理性疼痛大鼠的脊髓背角检测靶基因所表达蛋白的量,探索其和疼痛的相关性；4.以神经生长因子(NGF)分化PC12细胞,构建含有目的基因3’UTR序列的荧光素酶及细胞毒素检测因子,双报告基因的miRNA靶选择载体,以实验的方法验证生物信息学对其靶基因的预测；5.在NGF分化的PC12细胞,miRNA mimics对其Rapla蛋白表达的影响。研究方法：1.建立双侧坐骨神经结扎的神经病理性疼痛大鼠模型(bCCI),并通过疼痛行为学检测以证实建模的有效性；2.建模成功后在麻醉状态下处死大鼠,提取其痛觉传导通路不同部位的神经组织(双侧背根神经节、L4-L6脊髓背角、海马和前扣带回),用于RNA的提取；3.对提取的各部位组织的RNA,脊髓背角和背根神经节(DRG)的组织进行microRNA芯片检测,找出在bCCI大鼠差异表达的miRNA分子,在以上四个部位进行定量PCR验证；4.找出在脊髓背角差异表达最明显的miRNA分子,用生物信息学的方法对其进行靶基因预测；找出疼痛相关的可能有效靶基因；5.检测此基因在bCCI模型大鼠脊髓背角的表达量,构建含有此目的基因3’UTR的报告基因载体,以NGF分化的PC12细胞作为目的细胞,验证靶预测的结果；6.进一步用此差异表达的miRNA mimics转染NGF分化的PC12细胞,观察其在体外环境下对靶基因编码蛋白的抑制作用；7.统计方法：应用SPSS18.0及生物信息学软件。研究结果：1. bCCI神经病理疼痛模型建立成功,bCCI大鼠双侧足底机械痛阈和冷痛阈明显低于naive组和sham组大鼠(P<0.05或P<0.01)；2.在naive、sham和bCCI组大鼠背根神经节及脊髓背角,miRNA芯片及QPCR结果显示,bCCI组的大鼠miR-341的表达较naive及sham组明显升高(fold change>2,P<0.05),而在naive和sham组之间无显著差异。在脊髓背角,bCCI组大鼠]miR-203、miR-181a-l*及miR-541*的表达较naive及sham组明显降低(fold change>2, P<0.05),而在naive和sham组之间无显著差异。在海马和前扣带回以上差异表达的miRNA分子,三组之间无显著的统计学差异(P>0.05)；3.在以上结果中miR-203是在神经病理性疼痛状态下,脊髓背角表达量改变最明显的miRNA分子(表达量约降低10倍左右)。生物信息学分析显示,疼痛相关的基因Rapla是其有效的靶基因,且在bCCI大鼠脊髓背角表达量明显高于naive及sham组的大鼠；4.在NGF分化的PC12细胞中,用荧光素酶和细胞毒素检测因子,双报告基因的质粒,实验验证了Rapla的3’UTR是miR-203的靶基因(p<0.05)。且]miR-203mimics能够明显抑制其细胞内Rapla蛋白的表达。研究结论：bCCI大鼠痛觉传导的不同部位,miRNA的表达谱不同。在bCCI大鼠脊髓背角呈明显低表达的miR-203分子,在细胞水平证实疼痛相关基因Rapla是它的靶基因,并且能够明显抑制神经元性PC12细胞Rapla蛋白的表达。这些实验结果可以为Rapla蛋白及其下游的MAPK信号传导通路在神经病理性疼痛发病机制和治疗作用中的作用提供线索,从而为miR-203在神经病理疼痛局部基因治疗的进一步研究提供支持。