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目的：1.了解临床分离的耐甲氧西林葡萄球菌携带的mecR1和mecI基因的突变缺失情况,并比较这种突变缺失情况在金黄色葡萄球菌和凝固酶阴性葡萄球菌中的差别.
2.mecR1和mecI基因的突变缺失对mecA基因表达和甲氧西林耐药表型的影响.
3.建立应用实时荧光RT-PCR检测mecA基因表达的方法,并探讨mecA基因的表达水平与甲氧西林耐药水平的关系.
4.建立应用普通PCR和免疫捕获PCR检测阳性血培养瓶中葡萄球菌的方法.
方法：1.以PCR法检测临床分离的葡萄球菌是否携带mecA基因,以苯唑西林琼脂稀释法测定各菌株的苯唑西林MIC值.
2.以特异引物分别扩增mecR1基因的两个重要功能区MS区和PB区来检测mecR1基因的存在和缺失情况;以特异引物扩增mecI基因来检测其存在和缺失情况,并对完整的mecI基因测序来观察其突变情况.
3.根据NCBI上提交的mecA基因和16SrRNA基因序列设计特异引物,以实时荧光RT-PCR相对定量的方法检测mecA基因表达.
4.普通PCR.检测阳性血培养瓶中的葡萄球菌采用3对引物:第一对引物用来检测16SrRNA基因以确定是否为葡萄球菌,第二对引物用来检测ssa基因以确定是否为金黄色葡萄球菌,第三对引物用来检测mecA基因以确定是否为耐甲氧西林葡萄球菌.
5.免疫捕获PCR法检测金黄色葡萄球菌的方法如下:先以人IgG包被PCR管捕获阳性血培养瓶中的金黄色葡萄球菌,然后检测ssa基因加以确认,最后检测mecA基因以确定是否为耐甲氧西林金黄色葡萄球菌.
6.以常规方法为"金标准",评价普通PCR法和免疫捕获PCR法检测葡萄球菌的灵敏度和特异度.
结果：1.在收集到的葡萄球菌中,有155株携带mecA基因,其中金黄色葡萄球菌60株、表皮葡萄球菌58株和溶血葡萄球菌37株.两对引物检测金黄色葡萄球菌中携带的mecA基因的结果相同,但在两种凝固酶阴性的葡萄球菌中,两对引物检测mecA基因的结果有所不同,在6株表皮葡萄球菌和4株溶血葡萄球菌中,以引物mecA2-F、mecA2-R检测到mecA基因但以引物mecA1-F、mecA1-R未检测到.
2.琼脂稀释法检测苯唑西林MIC的结果显示:在60株携带mecA基因的金黄色葡萄球菌中,有58株的苯唑西林MIC值≥4μg/ml,但有2株的苯唑西林MIC值仅为1μg/ml和2μg/ml;95株携带mecA基因的凝固酶阴性葡萄球菌的苯唑西林MIC值≥1μg/ml.
3.mecR1基因的检测结果显示:三种葡萄球菌(金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌和溶血葡萄球菌)携带的mecR1基因MS区的百分率分别为83.3﹪、63.8﹪和16.2﹪,经X<2>检验三种葡萄球菌携带mecR1基因MS区的百分率有差别(X<2>=43.513,P<0.001),其中金黄色葡萄球菌携带mecR1基因MS区的百分率要高于溶血葡萄球菌(X<2>=42.249,P<0.001),表皮葡萄球菌携带mecR1基因MS区的百分率要高于溶血葡萄球菌(X<2>=20.638,P<0.001),但尚不能认为金黄色葡萄球菌与表皮葡萄球菌在携带mecR1基因MS区的百分率有差别(X<2>=5.814,P=0.016).三种葡萄球菌携带mecR1基因PB区的百分率分别为71.7﹪、27.6﹪和5.4﹪,经X<2>检验三种葡萄球菌携带mecR1基因PB区的百分率有差别(X<2>=47.481,P<0.001),其中金黄色葡萄球菌携带mecR1基因PB区的百分率要高于表皮葡萄球菌(X<2>=22.922,P<0.001),表皮葡萄球菌携带mecR1基因PB区的百分率要高于溶血葡萄球菌(X<2>=7.237,P=0.007),金黄色葡萄球菌携带mecR1基因PB区的百分率要高于溶血葡萄球菌(X<2>=40.404,P<0.001).综合MS区和PB区的检测结果,经X<2>检验,三种葡萄球菌携带完整mecR1基因在总体上有差别(X<2>=49.291,P<0.001),其中金黄色葡萄球菌携带完整mecR1基因的百分率要高于表皮葡萄球菌(X<2>=26.836,P<0.001),金黄色葡萄球菌携带完整.mecR1基因的百分率也高于溶血葡萄球菌(X<2>=38.529,P<0.001),但尚不能认为表皮葡萄球菌与溶血葡萄球菌携带完整mecR1基因的百分率有差别(X<2>=4.915,P=0.027>0.0125).
4.mecl基因的检测结果显示:在155株葡萄球菌中,mecl基因突变缺失情况十分常见,携带野生型mecl基因的仅有14株(9﹪).共检测到mecI基因的突变位点4个,分别为43位点(G→T)、163位点(A→T)、202位点(C→T)和343位点(G→T),其中以202位点最为常见,有36株(占83.7﹪):52株葡萄球菌携带的mecI基因中有两种不同长度的不完整ISll82片段插入;有46株葡萄球菌的mecl基因缺失.
5.实时荧光PCR相对定量检测60株葡萄球菌中mecA基因的表达后分析显示,meca基因的表达与葡萄球菌对甲氧西林的耐药水平并无直接相关性.
6.在493例血培养阳性报警瓶中,用常规方法检测到葡萄球菌214株,其中有MRS172株;用普通PCR法共检测到金黄色葡萄球菌22株和凝固酶阴性葡萄球菌189株,其中MRSA10株、MRCNS134株;免疫捕获PCR法共检测到金黄色葡萄球菌22株,其中MRSA 10株.以常规方法为"金标准",普通PCR法检测葡萄球菌的的灵敏度为98.6﹪,特异度为100﹪;免疫捕获PCR法检测金黄色葡萄球菌的灵敏度和特异度均为100﹪.
结论：1.在临床分离的金黄色葡萄球菌中,诱导基因mecR1可能是mecA基因表达的主要诱导因素;在临床分离的凝固酶阴性葡萄球菌中,由于诱导基因mecR1缺失严重,mecA基因表达的诱导则可能主要来自mecR1基因以外的因素.
2.在临床分离的耐甲氧西林葡萄球菌中,mecI基因的缺失突变可能是造成mecA基因表达的重要原因,但携带野生型mecI基因的菌株仍能表达pbp2a说明在某些葡萄球菌甚至在整个葡萄球菌中可能存在一种能逃避MecI蛋白阻抑作用而使mecA基因表达的机制.
3.葡萄球菌对甲氧西林的耐药水平与mecA基因的表达并无明显相关性.
4.普通PCR法和免疫捕获PCR法检测阳性血培养瓶中的葡萄球菌均具有较高的灵敏度和特异度,其检测时间约5h明显短于传统方法的48-72h,但两种方法的检测成本还较高,且只能将金黄色葡萄球菌鉴定到种而不能将凝固酶阴性葡萄球菌鉴定到种,因此还需进一步改进.