背景：　　非酒精性脂肪性肝病（nonalcoholic fatty liver disease，NAFLD）是目前全球范围内肝脏疾病最主要的病因。研究表明，成人NAFLD 患病率约为10%～45%，NAFLD在全球的患病率迅速增加，并与肥胖、2型糖尿病以及代谢综合症的患病率增加密切相关。NAFLD，特别是有病理表型的非酒精性脂肪性肝炎（nonalcoholic steatohepatitis， NASH），可能发展为进展期肝病，肝硬化和肝细胞癌。未来几十年，因 NAFLD 发展导致的终末期肝病可能成为最主要的肝移植指征。NAFLD 的人群患病率较高，给疾病的防治工作带来巨大挑战，同时给医疗卫生系统造成沉重负担。目前，尚缺乏针对NAFLD确切有效的治疗手段，使得NAFLD成为全球重要的公共卫生问题之一。　　NAFLD发病机制复杂，“两次打击学说”认为，肝脂肪变性为第一次打击，第二次打击为氧化应激引起的脂质过氧化损伤。研究表明，肝细胞线粒体功能障碍在NAFLD 发生发展中起关键作用。肝线粒体呼吸链功能增强可促进脂肪酸代谢，而线粒体抗氧化能力不足将导致活性氧簇（ROS）增多，氧化应激和炎性反应增加。沉默信息调节因子3（silent mating-type information regulation 2 homolog 3，SIRT3）是一种定位于线粒体的去乙酰化酶，在维持线粒体脂质代谢平衡和氧化还原稳态等方面起着关键作用。SIRT3缺失将导致细胞内ATP含量减少，并伴随着ROS水平的升高。高脂饲料喂养SIRT3基因敲除小鼠出现比野生型小鼠更严重的代谢综合征症状。不过，也有研究发现抑制SIRT3表达减少棕榈酸诱导脂毒性。因此，SIRT3在NAFLD模型中，是否具有维持线粒体功能和氧化还原稳态的作用还需进一步研究。　　近年来，大量研究证实植物化学物在慢性疾病防治中的有益作用。本实验室前期人群研究发现，二氢杨梅素（dihydromyricetin，DHM），一种主要来源于藤茶等天然植物的黄酮类化合物，能有效改善 NAFLD 患者的肝内脂肪蓄积，但其具体作用机制尚不明确，亟需深入研究。　　目的：　　阐明DHM通过SIRT3及其相关信号通路促进肝细胞线粒体功能（包括呼吸链功能和抗氧化能力），减少肝细胞脂肪变性和氧化应激损伤预防 NAFLD 发生的作用机制，为预防NAFLD发生提供新的膳食营养干预策略。　　方法：　　1、高脂饲料喂养SIRT3基因敲除小鼠和野生型小鼠12周建立NAFLD模型，DHM均匀混入饲料，小鼠自由摄取。观察DHM对小鼠体重及摄食量的影响；比较各组间小鼠肝脏脂质蓄积程度、血清学指标和病理改变情况，评价DHM对高脂饲料喂养的小鼠是否具有缓解NAFLD发生的作用。通过检测肝脏ATP含量和线粒体呼吸链复合体的酶活力以及表达水平，评价DHM对肝脏线粒体功能的影响。通过MDA检测试剂盒和免疫印迹法，检测DHM对肝脏脂质过氧化程度的影响。进一步检测SOD2酶活力和SOD2乙酰化水平来评价SIRT3在DHM发挥提高线粒体抗氧化能力中的作用。　　2、利用小鼠原代肝细胞和HepG2人肝癌细胞系，建立棕榈酸诱导肝细胞脂肪变性模型。通过检测细胞活力和肝细胞脂质蓄积情况，确定棕榈酸建模的最适浓度和DHM干预浓度。利用不同基因型的小鼠原代肝细胞，使用SIRT3特异性抑制剂3-TYP处理或转染siRNA干扰SIRT3后，探究SIRT3在DHM改善肝细胞脂肪变性中的作用。通过检测 HepG2 细胞耗氧率和线粒体呼吸链复合体的酶活力以及蛋白表达水平，评价DHM 对肝细胞线粒体功能的影响。通过检测 HepG2 细胞脂质过氧化程度和 MitoSOX探针标记的线粒体ROS含量，评价DHM对线粒体ROS水平的影响。同时，检测SIRT3去乙酰化酶活力在SOD2介导的DHM维持线粒体抗氧化能力中的作用。　　3、通过检测DHM对肝线粒体蛋白总体乙酰化水平和SIRT3酶活力的影响，以及通过qRT-PCR技术和免疫印迹法检测肝脏与肝细胞内SIRT3转录及表达情况，研究DHM对SIRT3表达的影响；通过SIRT3与MitoTracker共定位检测DHM对线粒体中SIRT3含量的影响。利用AMPK激动剂，AMPK抑制剂和 siRNA干扰技术，明确AMPK在DHM调控PGC1α、SIRT3表达中的影响。进一步通过双荧光素酶报告基因实验和染色质免疫沉淀技术（ChIP），探究PGC1α和ERRα在SIRT3转录调节中的作用，以明确DHM激活SIRT3表达的具体机制。　　结果：　　1、DHM可有效改善高脂饲料诱导的小鼠NAFLD发生，并减少肝脏脂质蓄积，抑制炎性反应，增强线粒体呼吸链功能和抗氧化能力，而SIRT3基因敲除后DHM的作用被消除。与高脂饲料喂养组相比，添加DHM使小鼠的体重和肝脏重量增加减缓，肝脏脂肪蓄积程度明显改善，肝脏病理学评分和转氨酶水平较低。但在SIRT3基因敲除小鼠中，我们未能观察到DHM缓解NAFLD的作用。高脂饲料诱导能引起肝内ATP产量减少，呼吸链复合体酶活力下降，而 DHM 能够显著恢复线粒体功能，促进线粒体生物合成，提高呼吸链复合体的酶活力。此外，高脂饲料诱导后小鼠肝脏 MDA 含量和4-HNE结合蛋白增多，出现明显的脂质过氧化反应。DHM能通过下调SOD2乙酰化水平，激活 SOD2，从而减轻脂质过氧化反应。而在 SIRT3 基因敲除小鼠的肝组织中，DHM抑制氧化应激的作用被阻断。　　2、DHM能够明显抑制棕榈酸诱导的肝细胞脂肪变性，增强肝细胞呼吸链复合体的表达和活性，促进SOD2的去乙酰化和ROS清除能力，而利用SIRT3抑制剂或特异性siRNA后DHM的作用被阻断。过量的棕榈酸具有脂毒性，能造成肝细胞内脂滴蓄积，并随棕榈酸浓度的增加而加重。DHM 预处理能有效改善肝细胞活力，减轻肝细胞脂肪变性程度，并呈剂量依赖关系。然而DHM对SIRT3基因敲除的原代肝细胞的脂肪变性无显著影响。同时，在使用SIRT3抑制剂和干扰SIRT3后，DHM抑制棕榈酸诱导的肝细胞脂肪变性的作用也被阻断。棕榈酸诱导能引起肝细胞线粒体呼吸功能和呼吸链复合体酶活力下降。DHM 能够显著恢复线粒体的呼吸能力，促进线粒体DNA编码基因的表达，提高呼吸链复合体的酶活力。抑制SIRT3活力后，DHM改善线粒体呼吸链功能的作用被抑制。我们还发现，棕榈酸诱导引发肝细胞内出现明显的脂质过氧化反应。DHM能通过SIRT3去乙酰化修饰SOD2，提高SOD2酶活力，进而提高线粒体清除ROS的能力。而在使用SIRT3抑制剂预处理和转染SIRT3 siRNA的HepG2细胞中，DHM抑制氧化应激的作用均被阻断。　　3、DHM 能通过调控 AMPK-PGC1α/ERRα 信号通路，促进 SIRT3 表达、活性及其线粒体转位，进而促进以SIRT3依赖的去乙酰化方式调控肝细胞线粒体呼吸功能和抗氧化能力的调节作用。高脂饲料诱导的小鼠 NAFLD模型或棕榈酸诱导肝细胞脂肪变性模型中，SIRT3表达下降且酶活力降低，而DHM可以恢复SIRT3的表达水平和酶活力。单独使用DHM处理肝细胞，可诱导SIRT3表达上调，并呈剂量依赖关系。使用DHM预处理后，DHM可有效抑制棕榈酸诱导的SIRT3表达和酶活力的下降。同时，DHM还能维持线粒体的正常形态，促进SIRT3的线粒体转位。进一步发现，DHM上调 SIRT3 表达主要通过上调 AMPK 磷酸化水平和 PGC1α 的蛋白表达水平，使用AMPK激动剂后，可产生类似DHM上调SIRT3表达的效果，但在使用AMPK抑制剂和干扰AMPK后，DHM上调PGC1α和SIRT3表达的作用被抑制。双荧光素酶报告基因实验证实干扰PGC1α或ERRα后，能减弱DHM促进SIRT3转录的作用。ChIP实验进一步证明了PGC1α和ERRα能结合于SIRT3的启动子区域。　　结论：　　本课题研究结果提示，DHM能够通过AMPK-PGC1α/ERRα信号通路上调肝细胞SIRT3表达、活性及促进其线粒体转位，进而通过SIRT3依赖的去乙酰化调节方式促进肝细胞线粒体呼吸功能和抗氧化能力，从而减少高脂诱导的肝脏脂质沉积或肝细胞脂肪变性，预防 NAFLD 发生。本研究为治疗 NAFLD 提供了新的靶点，同时，还为探索和开发基于DHM防治NAFLD的新措施提供了重要的科学基础。