1.研究背景和意义镉（Cadmium,Cd）是工业毒物和环境污染物,被国际癌症研究署（IARC）归类为第一类人类致癌物,镉及其化合物可引起人类系统损害以及相关肿瘤如前列腺癌、膀胱癌、头颈部癌、胰腺癌、肺癌、肾癌等。长时间接触镉会引起相关肿瘤的发生,比如骨骼系统、泌尿系统、生殖系统。镉引起癌症的分子机制较复杂,与DNA损伤、基因表达改变、DNA甲基化异常与增强脂质过氧化、细胞凋亡等机制相关。ASPM（Abnormal spindle microtubule assembly）基因位于1号染色体,是编码3477个氨基酸的蛋白质的基因,ASPM基因在DNA双链断裂修复的非同源末端的连接中也发挥了重要的作用,在多种胎儿组织以及几乎所有的人类转化细胞系中表达。目前有研究表明,ASPM mRNA表达在很多肿瘤中,比如髓母细胞瘤,胶质瘤,肝细胞癌与胰腺癌,前列腺癌等呈现上调。在ASPM引起肿瘤的分子机制中,有研究表明与DNA损伤有关。目前,ASPM基因在环境化学物的致肺损伤机制国内外鲜有报道,本课题结合镉致恶性转化细胞模型与亚慢性镉染毒大鼠模型,探索ASPM基因在镉致人支气管上皮细胞毒性中的作用。为ASPM基因作为镉接触的新分子标志物可能性以及为镉毒性机制研究的提供新思路。2.研究目的:2.1在本课题组前期已经建立的的镉恶性转化16HBE细胞模型的基础上,对16HBE细胞进行生物信息学方法分析,发现ASPM mRNA表达谱出现了差异化表达;在亚慢性镉染毒大鼠模型中,观察镉染毒后组织（肺、心、肝、肾）中ASPM mRNA的表达规律。通过进一步研究,查找资料对该基因的位点、形态、大小及保守性等生物学特性进行分析。2.2用氯化镉（不同时间、不同浓度）处理16HBE细胞中观察ASPM mRNA及其蛋白的差异表达,探讨ASPM在镉致16HBE细胞毒性急性损伤中的表达变化;2.3构建ASPM基因稳定低表达16HBE细胞株,研究ASPM低表达对细胞形态、生长周期、细胞凋亡等一般生物学特性的影响;2.4用氯化镉（不同时间、不同浓度）染毒ASPM基因稳定低表达细胞株,观察细胞抑制率、细胞凋亡,DNA损伤情况及细胞色素C释放量,探讨ASPM在镉致16HBE细胞急性毒性损伤中的作用。3.研究方法:3.1在前期构建的恶性转化模型中运用qRT-PCR技术检测ASPM在镉诱导恶性转化过程中的表达变化,观察ASPM的表达规律;3.2使用SPF级别SD大鼠,共四个剂量组:0.9%NaCl（对照组）,0.306mg/kg（低剂量组）,0.612mg/kg（中剂量组）和1.225mg/kg（高剂量组）;腹腔注射,连续染毒14周,每周染毒5次,用采用qRT-PCR技术检测大鼠体内主要脏器（肺、心、肝和肾脏组织）中ASPM表达情况;3.3运用qPCR实验方法检测检测不同剂量（0、10、20、30μmol/L）、不同时间（0、12、24、48h）氯化镉急性染毒后ASPM基因的表达水平;3.4利用慢病毒载体介导的细胞转染技术,把ASPM的短发夹双链RNA（shRNA）载体导入16HBE细胞。用嘌呤霉素筛选后分别命名16HBE-shASPM,用qRT-PCR验证ASPM基因缺陷细胞株mRNA的表达。并观察缺陷细胞的形态、细胞生长曲线和细胞周期等一般生物学特征。3.5对稳定ASPM缺陷细胞株用氯化镉进行不同剂量、不同时间染毒。用MTT、细胞流式、彗星实验以及细胞色素C等方法检测细胞的抑制率、细胞早期凋亡率、DNA损伤、细胞色素C释放及氧化应激损伤等。3.6本研究数据统计处理应用Microsoft Excel软件录入,数据分析应用软件SPSS16.0。qRT-PCR、细胞凋亡、细胞计数、MTT等每个样本3个平行,实验重复3次,SMTN基因mRNA的相对含量、细胞抑制率、凋亡率、SOD、MDA等均采用Mean±SD描述统计结果,三组及三组以上均数比较采用单因素方差分析,组间两两比较采用LSD法或者Dunnett T检验,以а=0.05作为检验水准,结果出现P<0.05为有统计学意义。4.结果:4.1 ASPM基因在恶性转化以及亚慢性镉染毒大鼠组织、镉致16HBE细胞急性损伤中的表达在前期建立的恶性转化模型中,ASPM在镉染毒第十四代和第十五代中呈现上调表达,与对照组16HBE相比,14^th和35^th分别增加2.92倍和3.44倍,差异有统计学意义（P<0.05）。在亚慢性镉染毒大鼠模型肺、心、肝、肾各组织中ASPM均呈不同倍数增加,与对照组相比,差异有统计学意义（P<0.05）。分别用不同浓度CdCl₂处理16HBE细胞24h以及用30μmol/LCdCl₂分别处理16HBE细胞不同时间,随着氯化镉染毒剂量的增加,ASPM mRNA的表达逐渐上升。与对照组相比,10、20、30μmol/LCdCl₂处理组细胞ASPM mRNA的相对表达量分别为6.03±1.91,13.42±1.28,43.42±6.02,与未染毒组比较差异有统计学意义（P<0.05）。随着氯化镉染毒时间的增加,ASPM mRNA的表达逐渐上升。与对照组相比,细胞ASPM mRNA的相对表达量分别为5.09±0.61,12.87±2.31,17.98±2.42,与对照组比较差异有统计学意义（P<0.05）。4.2构建ASPM基因沉默稳定细胞株在相同培养条件下,与16HBE相比,低表达细胞16HBE-shASPM在细胞形态上未见明显改变。在相同培养条件下,16HBE与16HBE-shASPM的倍增时间分别为22.09 h与22.56 h,两株细胞在96h时,16HBE-shASPM细胞计数低于16HBE细胞,差异有统计学意义（P<0.05）。4.3 ASPM基因对DNA损伤的影响经过H₂O₂处理后16HBE-shASPM细胞的DNA损伤比16HBE细胞高,差异具有统计学意义（P<0.05）。用不同浓度CdCl₂分别染毒16HBE细胞以及16HBE-shASPM细胞24小时后,与对照组相比,细胞DNA损伤指标随着染毒剂量的增加而增大。与相同处理16HBE细胞相比,16HBE-shASPM细胞的各个DNA损伤指标值均增加,差异具有统计学意义（P<0.05）。用30μmol/LCdCl₂染毒16HBE细胞不同时间后,与对照组相比,16HBE细胞随着染毒时间的延长,DNA损伤的各个指标值也随之增大,差异有统计学意义（P<0.05）。16HBE-shASPM细胞的4个DNA损伤指标值均高于相同处理下的16HBE细胞,差异有统计学意义（P<0.05）。4.4 ASPM基因在CdCl₂急性染毒后对细胞活性的影响不同浓度氯化镉处理16HB细胞后,随着染毒剂量的增加,细胞的抑制率升高,在CdCl₂浓度为低浓度10、20μmol/L时,16HBE-shASPM细胞的抑制率稍高于16HBE细胞,在CdCl₂浓度为高浓度30、40μmol/L时,细胞抑制率接近于100%。用20μmol/L的CdCl₂染毒液对16HBE细胞处理不同时间后,随着染毒时间的延长,各细胞的抑制率升高,且在各个时间点16HBE-shASPM细胞的抑制率高于16HBE细胞,差异有统计学意义（P<0.05）。4.5 ASPM基因对CdCl₂致细胞株凋亡的影响用不同CdCl₂剂量处理后,与同组16HBE细胞相比,16HBE-shASPM细胞早期凋亡比例16HBE细胞高,且差异有统计学意义（P<0.05）。用30μmol/L CdCl₂处理不同时间后,与相同氯化镉染毒时间点的16HBE细胞相比,16HBE-shASPM细胞的凋亡率高,且差异具有统计学意义（P<0.05）。4.6 ASPM基因对氯化镉处理细胞后细胞色素C的影响16HBE细胞以及16HBE-shASPM细胞的Cyt-C的释放量随着CdCl₂剂量的增加而增加。30μmol/L CdCl₂剂量组,16HBE-shASPM细胞的释放量远高于16HBE细胞,且差异具有统计学意义（P<0.05）。随着CdCl₂染毒时间的延长,16HBE细胞以及16HBE-shASPM细胞的释放量呈现出升高的趋势。在48h时间点,16HBE-shASPM细胞Cyt-C释放量明显高于16HBE细胞,且差异具有统计学意义（P<0.05）。4.7 ASPM基因在CdCl₂急性染毒后对SOD、MDA的影响与未用CdCl₂处理的16HBE细胞相比,16HBE细胞随着CdCl₂染毒剂量与时间的增加,SOD活性出现降低,MDA出现增加的趋势;与相同CdCl₂剂量点和时间点处理的16HBE细胞相比,ASPM缺陷细胞的SOD含量低于16HBE细胞,而MDA含量高于16HBE细胞（P<0.05）。5.结论5.1 ASPM基因在细胞恶性转化以及亚慢性中毒大鼠各组织中、镉致急性损伤细胞mRNA表达随着染毒剂量的增加时间的延长表达升高,存在明显的剂量反应关系,提示ASPM基因参与镉致急性以及亚慢性损伤过程中。5.2成功构建了ASPM基因稳定低表达细胞株,ASPM低表达细胞株的细胞形态与16HBE细胞没有差异;细胞生长至96h时,16HBE细胞比16HBE-shASPM细胞的生长速度快。5.3分别用不同浓度CdCl₂处理16HBE细胞相同时间以及用相同浓度CdCl₂处理16HBE细胞不同时间,与相同处理条件下的16HBE细胞相比,ASPM基因低表达细胞株在镉处理后抑制率、DNA氧化损伤程度、MDA含量增加,而SOD含量降低,且细胞凋亡率以及细胞色素C释放量均增加,提示ASPM基因在镉致细胞急性损伤过程中发挥重要作用。