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随着表观遗传学研究的深入,基因的异常甲基化已经受到人们的充分认识,肿瘤相关基因发生的甲基化,可以导致其表达失活从而丧失其功能。因此在肿瘤的早期诊断和筛查过程中,基因异常甲基化的改变也许可以为此提供一个重要的分子标记。去甲基化药物的机制和作用,目前大都处于研究阶段,它的出现也为临床肿瘤病人的治疗提供一个新的方法和途径。食管癌是一种我国常见的消化道恶性肿瘤,严重的威胁了人类的健康。对于食管癌相关基因甲基化情况的研究,目前相对集中在某些抑癌基因,错配修复基因等。而细胞凋亡相关基因 TIMP3和与肿瘤远端转移相关的E-cadherin基因,在食管癌中的甲基化情况还未完全明了。其表达状态的改变与甲基化修饰是否有关?改变这些基因的甲基修饰状态对食管癌细胞中该基因表达是否会有影响及对细胞的肿瘤特性有何影响均未见相关报道。
本研究采用甲基化特异性PCR和免疫细胞化学的方法,观察食管癌细胞系EC1和EC9706中TIMP3、E-cadherin基因甲基化的水平及蛋白表达情况,初步探讨其基因表达失活与甲基化的关系。并用去甲基化药5-杂氮-2’-脱氧胞苷(5-Aza-CdR)和传统化疗药物5-Fu,分别处理食管癌细胞系EC1和EC9706,观察这两种药物作用后TIMP3、E-cadherin基因甲基化状态、蛋白表达的改变及对细胞周期的影响,了解去甲基化药物的优势及前景,为药物应用于临床治疗提供依据
方法:
1体外培养的食管癌细胞系EC1和EC9706,于RPMI1640培养基(内含10%胎牛血清和100U/ml青霉素、100U/ml链霉素)中贴壁培养(37℃,5%CO2)。观察细胞形态。
2提取细胞EC1和EC9706的DNA,经质量鉴定后,应用甲基化特异性PCRt(MSP)的方法,检测食管癌细胞系EC1和EC9706中TIMP3和E-cadherin基因甲基化的水平。
3制作细胞爬片,应用免疫细胞化学的方法,检测食管癌细胞系EC1和EC9706中TIMP3和E-cadherin蛋白表达的情况。
4体外培养的两种食管癌细胞系,分别在含5-杂氮-2’-脱氧胞苷(5-Aza-CdR)的培养基,及含5-Fu的培养基中,贴壁培养(37℃,5%CO2),并观察细胞形态的变化。
5提取用药物干预后的细胞EC1和EC9706的DNA,经质量鉴定后,应用甲基化特异性PCR(MSP)的方法,检测TIMP3和E-cadherin基因甲基化的水平的变化。
6制作经药物处理后的细胞的爬片,用免疫细胞化学的方法检测TIMP3和E-cadherin基因蛋白表达改变的情况。
7同时培养未加药的EC1和EC9706细胞,及经5-Aza-CdR和5-Fu处理过的细胞,消化离心后,乙醇固定,进行流式细胞仪检测细胞周期的变化。
结果:
1 TIMP3基因在食管癌细胞系EC1和EC9706中都表现为非甲基化,且蛋白呈现弱表达。E-cadherin基因在食管癌细胞系EC1中发生甲基化,在EC9706中发生半甲基化,其蛋白表达均缺失。
2 TIMP3基因在经5-Aza-CdR和5-Fu作用后的EC1和EC9706细胞系中,仍为非甲基化;而在EC1中发生甲基化、EC9706中发生半甲基化的E-cadherin基因,经5-Aza-CdR作用后,甲基化的状况都得到了逆转;经5-Fu作用后的两种细胞系中该甲基化的情况没有改变。
3但经药物5-Aza-CdR和5-Fu分别作用后,TIMP3和E-cadherin基因的蛋白表达都由原来的弱表达和不表达,转变为表达增强和表达。
45-Aza-CdR和5-Fu均能使处于G1期的细胞比例增加,S期的细胞减少。用药组与未加药组之间及两种药物组之间的差异有统计学意义(P<0.05)。
结论:
1在食管癌细胞系EC1和EC9706中呈低表达的两种基因E-cadherin、TIMP3其甲基化状态不同,前者甲基化程度高,而后者未发生甲基化。E-cadherin基因的甲基化可能为临床食管癌的分子诊断和病情评估提供一个分子标记。
25-Fu不能改变食管癌细胞系EC1和EC9706中E-cadherin、TIMP3基因的甲基化状态,但可抑制肿瘤细胞增殖。5-Aza-CdR.有效降低E-cadherin基因的甲基化水平并使其蛋白恢复表达,也可抑制肿瘤细胞增殖,提示去甲基化药物可能是治疗肿瘤的又一途径。