论文部分内容阅读
非洲猪瘟（African swine fever,ASF）是由非洲猪瘟病毒（African swine fever virus,ASFV）引起的一种高发病性和高死亡性的传染病,死亡率高达100%,临床症状主要表现为高热、呼吸困难、精神沉郁、皮下出血等。自2018年首个ASF病例在辽宁沈阳出现后,疫情迅速蔓延至全国,给全国的养猪产业带来毁灭性打击。国内猪肉价格一度大涨,对国民生计产生了极大影响。由于ASFV基因组大、变异迅速且具备一套完整的免疫逃避机制,ASF疫苗研发存在很大的困难,现阶段尚没有有效的ASF商品化疫苗。由此可见,早期发现与诊断对ASF疫情的防控起着至关重要的作用。本研究旨在在抗原、抗体两个方面分别建立ASFV检测技术。具体研究内容如下:1、非洲猪瘟病毒多重荧光定量PCR方法的建立本试验根据非洲猪瘟病毒基因序列（No.MK333180.1）分别设计出了3对特异性引物和Taqman探针,通过优化p72、CD2v、MGF360三对引物、探针的浓度和比例,建立了一种ASFV多重鉴别荧光定量PCR检测方法,并验证其特异性、灵敏度、重复性。结果显示,建立的鉴别检测方法在1010-5拷贝/μL模板范围内有良好的线性关系,能够对ASFV的p72、CD2v、MGF三种基因出现阳性扩增信号,但对猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪伪狂犬病病毒、猪圆环病毒2型病毒、猪瘟病毒、副猪嗜血杆菌和猪链球菌2型等阳性病原对照未出现扩增。批内及批间试验变异系数均小于2.5%,说明具有良好的重复性。对ASFV中p72、CD2v、MGF的最低检测模板浓度分别为10~1拷贝/μL、10~2拷贝/μL、10~1拷贝/μL。该方法还可以通过检测CD2v基因和MGF基因来区分ASFV野毒株、CD2v单基因缺失株、CD2v和MGF双基因缺失株。用该方法对115份环境样品进行了ASFV多重检测,并与三种商品化试剂盒进行比对,结果显示115份环境样品中有32份阳性样品,检测结果与其余三种试剂盒检测结果相同,且阳性样品的Ct值具有良好的相关性。本研究成功建立了能够鉴别ASFV野毒株与基因缺失株的多重鉴别荧光定量PCR方法,为临床上鉴别ASFV野毒株与基因缺失株提供更快捷、有效的方法。2、非洲猪瘟病毒p30、p22蛋白的原核表达及纯化本研究成功构建出重组质粒p ET-32a-p30和p ET-32a-p22。将成功构建的两个阳性质粒分别转化到BL21感受态细胞中,经IPTG诱导后获得目的蛋白,再通过镍柱亲和层析法获得纯化后的目的蛋白p30和p22。经Western blot结果分析,p30与p22蛋白均可与ASFV阳性血清发生特异性反应。两个蛋白均具有良好的反应原性。3、间接ELISA抗体检测方法的建立与应用本研究以纯化获得的p30、p22蛋白分别为包被抗原建立出两种ASFV间接ELISA检测方法。首先对包被蛋白浓度、样品稀释倍数、样品作用时间、二抗孵育时间、二抗稀释倍数等的一系列的ELISA反应条件进行摸索优化。结果显示,p30蛋白最佳反应条件为:蛋白包被浓度为0.4 mg/L;最佳封闭液为5%脱脂奶粉;最佳封闭时间为90 min;样品最佳稀释倍数为600;样品最佳作用时间60 min;酶标二抗最佳稀释度30000倍;底物最佳作用时间为10 min。p22蛋白最佳反应条件是:蛋白包被浓度为0.11mg/L;最佳封闭液为5%脱脂奶粉;最佳封闭时间为60 min;血清最佳稀释度为600倍;样品最佳作用时间60 min;酶标二抗最佳稀释度40000倍;底物最佳作用时间15 min。用上述建立的两种间接ELISA方法验证其灵敏性、特异性和与商品化试剂盒样品检测的符合率。用p30-ELISA、p22-ELISA两种方法分别检测PCV、PRV、PRRSV、CSFV和HPS 5种阳性灭活血清,结果显示样品的OD450均小于阴性临界值,表明p30-ELISA、p22-ELISA两种方法特异性良好。用上述建立的两种方法分别检测184份临床样品,p30-ELISA、p22-ELISA与进口的商品化试剂盒样品检测结果的符合率分别为95.1%、87.5%。结果表明:p22-ELISA方法的样品检测符合率明显低于p30-ELISA方法。综上所述,本试验分别在抗原、抗体两个方面建立了ASFV检测方法。多重荧光定量PCR方法的建立对ASFV野毒株与基因缺失株的鉴别诊断有重要的意义,p30-ELISA方法的建立对ASF大规模流行病学的调查及对无明显临床症状病猪的筛查发挥重要的作用。