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氨基糖苷类抗生素是临床上治疗革兰氏阴性菌所致严重感染的常用药,常与β?内酰胺类抗生素联合应用。近年来,细菌对此类抗生素的耐药率不断上升,且已出现对β-内酰胺类、氨基糖苷类抗菌药物同时耐药的多重耐药菌株的流行。对大肠杆菌中新出现的耐药机制进行研究有利于进一步了解耐药的分子机理,指导临床用药。1、大肠杆菌氨基糖苷类耐药表型及基因型分析本研究采用K-B纸片法对224株大肠杆菌进行5种氨基糖苷类药物的药敏试验,采用微量肉汤稀释法进行庆大霉素和阿米卡星最低抑菌浓度(MIC)的测定,三重PCR法检测全部菌株氨基糖苷类钝化酶基因ant(3″)-Ia、aac(6′)-Ib和aph(3′)-IIa,普通PCR法检测16S甲基化酶基因。结果表明,山东省禽源大肠杆菌对链霉素、庆大霉素、卡那霉素、新霉素和阿米卡星的耐药率分别为84.4%、57.1%、55.8%、46.9%和40.2%。三种钝化酶基因ant(3″)-Ia、aac(6′)-Ib、aph(3′)-IIa的检出率依次为49.6%、25.0%、22.8%,介导高水平耐药的16S甲基化酶基因RmtB的检出率为11.6%(26/224),只有一株大肠杆菌检测到armA基因,没有检测到rmtA,且三种甲基化酶基因在低度耐药菌中检出率均为0。所检大肠杆菌中携带2种及2种以上耐药基因的菌株占33.5%(75/224),有一株大肠杆菌同时携带4种耐药基因。本研究结果表明氨基糖苷类钝化酶及16S甲基化酶广泛存在于禽源大肠杆菌菌中,其耐药性与相关耐药基因的检出率基本呈正相关。2、氨基糖苷类耐药质粒的鉴定及其携带率的检测根据试验一的结果,选取大肠杆菌XZDC株(其MIC阿米卡星>1280μg/ml,MIC庆大霉素=512μg/ml),采用碱裂解法提取质粒,并将提取的质粒连续转化大肠杆菌DH5α三次,以保证其稳定遗传,将此质粒命名为pXZ,然后进行测序分析。为了解pXZ在大肠杆菌中的流行情况,建立三重PCR方法检测其携带率。结果表明,pXZ为全长76,635bp、G+C%为51.65%的环状分子,GenBank的登录号为JF927996,由62kb的骨架区和14kb的耐药决定区构成,耐药决定区含有4个耐药基因,分别为rmtB、fosA3、blaTEM-1和blaCTX-M-24,能够介导氨基糖苷类、磷霉素和β-内酰胺类的多重耐药。三重PCR的检出率为17/224,占rmtB阳性的高度耐药菌株(阿米卡星和庆大霉素任一MIC≧512μg/ml)的64.5%(17/26),表明类pXZ质粒主要介导高浓度耐药。3、CTX-M-9组编码基因DNA序列测定与及基因型的确定根据同源性不同,产超广谱β-内酰胺酶(extended-spectrum beta-lactamases,ESBLs)基因CTX-M分为五组:CTX-M-1组、CTX-M-2组、CTX-M-8组、CTX-M-9组和CTX-M-25组,每组又分为许多不同的基因亚型。pXZ携带blaCTX-M-24基因,属于CTX-M-9组。为确定试验二中三重PCR检测为类pXZ阳性的17株大肠杆菌中CTX-M-9组基因亚型,设计引物用于扩增CTX-M-9组基因完整的ORF,并对PCR产物测序确定其亚型。序列分析结果表明,17株类pXZ阳性的大肠杆菌中一株为blaCTX-M-14,16株为blaCTX-M-24。