国际糖尿病联盟数据显示,2019年全球20-79岁成人死亡人数中,因患糖尿病而致死的约占11.3%;65-99岁年龄段人群中,糖尿病患病率约占19.3%(约1.356亿),预计到2030年,65岁以上(65-99岁)的糖尿病患者人数将达到1.952亿,2045年约2.762亿。这些数据表明糖尿病是全球人口老龄化社会的慢性疾病负担,预防糖尿病及其并发症对延缓衰老与衰老相关性疾病的研究,应对人口老龄化意义重大。流行病学调查研究显示,糖尿病血管病变是糖尿病患者主要常见并发症,与糖尿病血糖波动密切相关,是其他多种并发症发生的病理基础。血管是人体多种器官的重要组成部分,血管衰老是引起人体多器官系统衰老的重要病理生理基础,是血管相关性疾病发生的高危因素,故研究糖尿病血管衰老及其并发症对延缓糖尿病血管病变,提高老年人身体健康刻不容缓。糖尿病血管衰老分糖尿病大血管衰老和糖尿病微血管衰老,其中胸主动脉和颈总动脉是大血管衰老主要损伤部位,胸主动脉和颈总动脉作为心脑的主要供血部位,两血管衰老可进一步加重心肌纤维化、脑认知功能障碍等心脑血管损伤,导致心脑老化。血管平滑肌细胞(Vascular Smooth Muscle Cell,VSMC)作为血管壁中膜的主要构成成分,其异常增殖、迁移、细胞周期改变和表型转化,是导致VSMC衰老,加速血管衰老,最终诱导糖尿病血管衰老的重要病理因素。腺苷酸活化蛋白激酶(AMP-activated protein kinase,AMPK)/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(Mammalian target of rapamycin,mTOR)通路是影响衰老的主要信号通路,现大量研究发现,AMPK/mTOR通路在糖尿病大血管损伤、糖尿病心脏病、糖尿病脑病、糖尿病肾病及糖尿病视网膜损伤等糖尿病血管病变方面具有重要预防和保护作用,也是影响VSMC增殖、迁移和表型转化的重要途径,可减少VSMC衰老,参与血管衰老进程,并与糖代谢关系密切。因此基于AMPK/mTOR通路探讨益气活血药延缓糖尿病血管衰老及其并发症心脑老化的作用机制意义重大。人参三七川芎提取物(Ginseng Radix et Rhizoma,Notoginseng Radixet Rhizomaand Chuanxiong Rhizomaextracts,GSC)是益气活血药人参、三七、川芎的醇提取物,前期药理学研究显示,GSC具有较好的抗衰老功效,在一定程度上可以从整体、血管组织、细胞和分子水平延缓大鼠生理性血管衰老和复制性血管内皮细胞和VSMC衰老。但对于疾病造成的病理性血管衰老的机制及GSC对此类血管衰老及并发症的干预研究仍处于初步阶段。因此本研究通过构建体内糖尿病小鼠血管衰老及血管衰老并发症模型和体外高糖诱导人主动脉血管平滑肌细胞(Human Aortic Smooth Muscle Cell,HASMC)衰老模型,观察益气活血药GSC对糖尿病小鼠颈总动脉、胸主动脉血管衰老,心脑老化及高糖诱导HASMC衰老的保护作用,并以AMPK抑制剂和基因转染技术抑制HASMC中AMPK表达为切入点,探讨基于AMPK/mTOR通路GSC对高糖诱导HASMC衰老的调节作用和机制。第一部分益气活血药延缓糖尿病血管衰老及其并发症的体内实验研究实验一益气活血药延缓糖尿病小鼠颈总动脉和胸主动脉血管衰老的机制研究目的:探讨GSC对糖尿病小鼠颈总动脉和胸主动脉血管衰老的作用机制。方法:腹腔注射链脲佐菌素(Streptozotocin,STZ)联合高脂饲料长期喂养诱导糖尿病小鼠模型,造模7个月后,随机分为空白对照(Control)组、糖尿病(HG)组、GSC-L组、GSC-H组和二甲双胍(Met)组,连续给药9周。取材前购进新一批4周龄雄性C57BL/6小鼠正常适应性喂养7天,作为青年(Young)组。观察各组小鼠一般状态,检测小鼠随机血糖,使用苏木精-伊红(HE)染色、胶原纤维(Masson)染色结合透射电镜(TEM)检测小鼠颈总动脉病理形态学变化,采用冯库萨(Von Kossa)染色检测小鼠颈总动脉、胸主动脉钙盐沉积程度,免疫组化(IHC-P)和蛋白免疫印迹法(WB)检测小鼠颈总动脉和胸主动脉中基质金属蛋白酶2(Matrix metalloproteinases 2,MMP-2)、周期蛋白依赖激酶抑制因子2A(p16)、周期依赖性蛋白激酶抑制因子1A(p21)、runt 相关转录因子-2(Runt-related transcriptionfactor-2,Runx2)、骨桥蛋白(Osteopontin,OPN)、α-平滑肌肌动蛋白(α-smoothmuscle actin,α-SMA)与平滑肌 22α 蛋白(Smooth Muscle 22α,SM22α)蛋白表达。结果:Young组和Control组小鼠体型适中、反应灵敏、活泼好动、毛发黑亮有光泽,血糖较低,颈总动脉、胸主动脉病理形态学改变较轻,各衰老蛋白表达较正常;与Control组相比较,HG组小鼠体型瘦弱、反应迟钝、弓背捲体、精神萎靡、毛竖无光泽间杂黄白色毛发,血糖升高显著(P<0.01)。颈总动脉血管纤维化,血管壁内皮细胞和VSMC损伤严重,胞质裂解、突起,胞内空泡和溶酶体等大量增多,中外膜厚度,颈总动脉和胸主动脉血管钙盐沉积程度等血管病理形态学改变加重(P<0.01)。颈总动脉和胸主动脉OPN蛋白表达增加,SM22α蛋白表达减少(P<0.01)。颈总动脉Runx2、p16、p21和MMP2蛋白高表达,α-SMA低表达(P<0.01);与HG相比较,GSC-L、GSC-H和Met组小鼠外在衰老状态明显好转,血糖下降显著(P<0.05),颈总动脉血管纤维化、血管壁中内膜层超微结构、中外膜厚度、颈总动脉和胸主动脉血管钙盐沉积程度明显减轻(P<0.01)。颈总动脉和胸主动脉OPN蛋白表达减少,SM22α蛋白表达增强(P<0.05)。颈总动脉Runx2、p16、p21和MMP2蛋白高表达被抑制,α-SMA表达增强(P<0.05)。结论:高糖可以通过改变小鼠一般状态,刺激颈总动脉血管纤维化、血管壁中内膜层超微结构、中外膜厚度,颈总动脉和胸主动脉血管钙盐沉积程度等血管衰老病理形态学变化改变,调节MMP2、p16、p21、Runx2、OPN、α-SMA、SM22α相关衰老蛋白表达,诱导小鼠颈总动脉和胸主动脉血管衰老。GSC可以降低糖尿病小鼠血糖水平,改善小鼠外在衰老状态和体内血管衰老病理性变化,延缓糖尿病小鼠颈总动脉和胸主动脉血管衰老,其作用机制可能是通过调节MMP2、p16、p21、Runx2、OPN、α-SMA、SM22α蛋白表达来发挥作用。实验二基于AMPK/mTOR通路探讨益气活血药对糖尿病小鼠心脏老化的影响目的:观察GSC在糖尿病小鼠心脏老化中对AMPK/mTOR通路的影响。方法:由于体内实验一显示Young组和Control组糖尿病小鼠血管没有出现显著衰老病理变化,故在检测糖尿病心肌纤维化时只分Control组、HG组、GSC-L组、GSC-H组和Met组五组。其余分组同体内实验一。分别使用HE、Masson、Von Kossa结合TEM检测小鼠心脏组织病理形态学改变,采用IHC-P和WB检测心脏组织中胶原蛋白Ⅰ型(Collagen types I,Collagen I)、胶原蛋白Ⅲ型(Collagen types Ⅲ,Collagen Ⅲ)、转化生长因子 β1(Transforming growth factor-β1,TGF-β1)蛋白表达,WB 检测 MMP-2、抑癌基因 p53(Tumor suppressor p53,p53)、磷酸化抑癌基因 p-p53(Phospho-tumor suppressor p53,p-p53)蛋白和 AMPK/mTOR 通路表达。结果:Young和Control组小鼠心肌纤维、心肌细胞排列均匀致密、有规则,结构清晰完整。心脏微血管染色均匀,未见明显钙盐沉积。MMP2、p53、p-p53及AMPK/mTOR通路表达不显著;与Control组相比较,HG组心肌细胞体积增大,核皱缩,线粒体肿胀、变性、线粒体嵴空泡化,甚至断裂。细胞间隙增宽,排列紊乱,多见炎细胞浸润,并可见灶性坏死。心脏微血管正常结构被破坏,血管弹性纤维间有大量棕色钙盐颗粒沉积,心肌间质尤其是在微血管周围有蓝染胶原纤维大量沉积(P<0.01)。心肌中CollagenⅠ、Collagen Ⅲ、TGF-β1、MMP2、p53、p-p53 蛋白高表达,p-LKB1/LKB1、p-AMPK/AMPK蛋白比值显著降低,p-mTOR/mTOR、p-p70S6K/p70S6K蛋白比值升高显著(P<0.05)。与HG组相比较,GSC-L、GSC-H和Met组小鼠心脏组织病理形态学显著改善(P<0.05),CollagenⅠ、CollagenⅢ、TGF-β1、MMP2、p53、p-p53 蛋白表达水平下降,可有效上调 p-LKB1/LKB1 和 p-AMPK/AMPK 蛋白比值,下调 p-mTOR/mTOR、p-p70S6K/p70S6K 蛋白比值(P<0.05)。结论:高糖通过刺激小鼠心脏发生心肌纤维化、心脏超微结构改变、心脏微血管纤维化和钙化等病理形态学改变,增加心肌纤维化标志物Collagen Ⅰ、Collagen Ⅲ、TGF-β1和衰老蛋白MMP2、p53和p-p53表达,促进AMPK/mTOR通路中各蛋白异常表达,从而诱导心脏老化。GSC能够改善糖尿病小鼠心脏病理形态学变化,延缓心脏老化,其作用机制可能是通过调控AMPK/mTOR通路表达,抑制Collagen Ⅰ、Collagen Ⅲ、TGF-β1、MMP2、p53和p-p53蛋白表达来发挥作用。实验三基于AMPK-mTOR通路探讨益气活血药对糖尿病小鼠脑老化的影响目的:观察GSC在糖尿病小鼠脑老化中对AMPK/mTOR通路的影响。方法:由于体内实验一和实验二显示Young组和Control组糖尿病小鼠血管没有出现显著衰老病理变化,故在检测糖尿病小鼠海马区尼氏体数量变化和神经元损伤时,没有检测Young组病理变化。其余分组同体内实验一。使用旷场实验检测小鼠行为学变化,分别使用HE、Nissl、Von Kossa结合TEM检测小鼠脑组织海马区组织病理形态学改变,采用IHC-P检测海马组织晚期糖基化终末产物(Advanced glycation end-product,AGE)和β-淀粉样蛋白(β-amyloid,Aβ)蛋白表达,WB检测海马组织AGE、糖基化终末产物受体(Receptor of advanced glycation end-products,RAGE)、Aβ、MMP2、p53、p-p53 和AMPK/mTOR通路表达。结果:Young和Control组小鼠行为学、脑微血管病理形态学及超微结构无显著改变,衰老蛋白及AMPK/mTOR通路表达无显著差异;与Control组相比较,HG组小鼠中央活动总时间和总行径路程均显著下降(P<0.01),脑微血管内细胞数量减少、排列紊乱,可见血管腔狭窄,血管壁有棕色颗粒沉积。神经元核膜皱缩,染色质分布不均匀,电子密度低,胞浆内细胞器部分溶解消失,脑微血管壁结构欠清晰。尼氏体、神经元和锥体细胞数量减少(P<0.01)。海马区AGE、RAGE、Aβ、MMP2、p53和p-p53的蛋白表达水平显著增加,AMPK/mTOR通路表达存在显著差异(P<0.01);与HG组相比较,各药物干预组小鼠行为学、脑微血管病理形态学均显著改善,海马CA1、CA3和DG区神经元变性减轻,尼氏体、神经元和锥体细胞数量增加(P<0.01),海马区AGE、RAGE、Aβ、MMP2、p53和p-p53蛋白活性显著下降,AMPK/mTOR通路表达被改善(P<0.05)。结论:高糖可以诱导小鼠海马区尼氏体数目减少,导致神经元受损及超微结构改变,加速脑微血管钙化等病理改变,增加AGE、RAGE、Aβ、MMP2、p53和p-p53蛋白表达,促使AMPK/mTOR通路中各蛋白异常表达,改变小鼠行为学变化,致使脑老化。GSC可以从行为学方面改善糖尿病小鼠的衰老状态,并通过抑制小鼠海马区尼氏体缺失和神经元损伤,缓解脑微血管钙化和海马区超微结构改变,充分发挥脑保护作用。其保护机制可能是通过调节AMPK/mTOR通路,抑制AGE、RAGE、Aβ、MMP2、p53和p-p53蛋白表达有关。第二部分益气活血药延缓高糖诱导血管平滑肌细胞衰老的体外实验研究实验一建立高糖诱导的HASMC衰老模型目的:探索一种稳定的高糖诱导的病理性HASMC衰老模型,为研究GSC延缓血管衰老提供一种新的细胞实验模型。方法:取第6或7代HASMC接种贴壁后,用无血清DMEM低糖基础培养基饥饿24h,然后选择5.5、11、22、33、44、66、88和110 mmol/L浓度的高糖培养基分别干预24h、48h、72h、96h,用MTT筛选诱导HASMC衰老的最佳高糖浓度和干预时间。继而依次使用β-半乳糖苷酶(SA-β-gal)染色检测细胞衰老程度,划痕实验和Transwell迁移实验检测细胞迁移能力,流式检测细胞周期,WB检测衰老相关蛋白MMP2、p53、p-p53和表型转化标志蛋白SM22α、α-SMA、Runx2、OPN和重组人骨形态发生蛋白-2(Recombinant Human Bone Morphogenetic protein-2,BMP-2)表达,进一步验证最佳高糖造模浓度和干预时间。结果:MTT结果显示:33 mmol/LD-Glucose干预HASMC 72h时,HG组细胞增殖活力显著下降,D-M组细胞增殖活力变化不明显,确立为诱导HASMC衰老模型最佳高糖浓度和干预时间。与Control组相比较,HG组HASMC增殖活力、迁移能力、S期细胞百分比及SM22α、α-SMA蛋白表达水平下降(P<0.05),SA-β-gal蓝染比率、G0/G1期细胞所占百分比及MMP2、p53、p-p53、Runx2、OPN、BMP-2蛋白表达水平上升(P<0.05)。结论:33 mmol/LD-Glucose培养基作用HASMC72h时,细胞衰老较为明显,为诱导HASMC衰老模型的最佳高糖浓度和最佳作用时间。HASMC衰老机制可能与改变细胞增殖迁移能力、SA-β-gal表达、细胞周期、表型转化,调节p53、p-53、MMP2、SM22α、α-SMA、Runx2、OPN、BMP-2 蛋白表达有关。实验二益气活血药对高糖诱导HASMC衰老的影响目的:观察GSC对高糖诱导的HASMC衰老的影响。方法:在体内实验一细胞模型的基础上,分别筛选GSC和Met最佳干预浓度,然后分为Control组、HG组、GSC-L组、GSC-M组、GSC-L组和Met组。在体内实验一检测方法的基础上,再使用免疫荧光检测α-SMA和OPN荧光表达。结果:与Control组相比较,HG组HASMC增殖活力、迁移能力、S期细胞百分比、α-SMA荧光表达及SM22α、α-SMA蛋白表达水平下降(P<0.05),SA-β-gal蓝染比率、G0/G1期细胞所占百分比、OPN荧光表达及MMP2、p53、p-p53、Runx2、OPN、BMP-2蛋白表达水平上升(P<0.05);与HG组相比较,GSC和Met干预组细胞增殖活力和迁移能力增加,细胞SA-β-gal蓝染比率和G0/G1期细胞所占百分比下降,S期上升,衰老蛋白MMP2、p53、p-p53及合成型标志物Runx2、OPN、BMP-2表达受到抑制,收缩型标志物SM22α、α-SMA蛋白表达水平增加(P<0.05)。结论:GSC通过改善HASMC增殖迁移能力、细胞周期、表型转化和β-半乳糖苷酶表达可延缓高糖诱导的HASMC衰老,其干预机制可能与降低MMP2、p53、p-p53、OPN、Runx2、BMP-2表达水平,增加SM22α、α-SMA表达水平密切相关。实验三基于AMPK/mTOR通路探讨益气活血药对高糖诱导HASMC衰老的影响目的:观察GSC在HASMC衰老中对AMPK/mTOR信号通路的影响。通过AMPK抑制剂和基因转染技术干扰AMPK活性与表达,进一步探讨GSC延缓HASMC衰老的作用机制。方法:在体内实验一细胞模型的基础上,基因转染技术干扰AMPK活性分为Control组、HG组、GSC组和Met组,其余分组同体内实验二。WB检测AMPK/mTOR通路活化,AMPK抑制剂Compound C和AMPKα1慢病毒颗粒干扰AMPK活化后,采用体内实验一检测方法进行具体指标检测。结果:1)与Control组相比较,HG组HASMC p-AMPK/AMPK比值下调,p-mTOR/mTOR比值上调(P<0.01);与HG组相比较,药物干预组p-AMPK/AMPK和p-mTOR/mTOR比值趋于正常(P<0.05)。2)Compound C抑制AMPK活性后,与HG组相比较,药物干预组HASMC增殖迁移能力、细胞周期改变、SA-β-gal蓝染比率、表型转化及 MMP2、p-p53、p53、Runx2、OPN 和 BMP-2 蛋白表达和 AMPK/mTOR 通路表达方面尚未有显著差异。3)AMPKα1沉默后,与SCR shRNA阴性对照组比较,AMPKα1 shRNA转染后HASMC中AMPK磷酸化与未磷酸化表达水平下调(P<0.01),mTOR磷酸化与未磷酸化表达水平上调显著(P<0.01),HASMC增殖迁移能力及SM22α、α-SMA蛋白表达均下降,MMP2、p-p53、p53、Runx2、OPN和BMP-2蛋白表达上调,部分具有统计学差异(P<0.05,P<0.01);与HG组相比较,药物干预组HASMC增殖迁移能力、表型转化及衰老相关蛋白和AMPK/mTOR通路表达尚未有显著差异。结论:AMPK/mTOR通路参与高糖诱导HASMC衰老这一过程,GSC可以调控AMPK/mTOR通路,保护HASMC衰老。通过AMPK抑制剂和RNA干扰技术干扰AMPK表达后,GSC抑制高糖诱导HASMC衰老的作用显著减弱。提示GSC抑制高糖诱导HASMC衰老的作用机制,部分可能来源于对AMPK/mTOR通路的调控。综上所述,本研究利用体内糖尿病小鼠血管衰老及血管衰老并发症模型及体外高糖诱导的HASMC衰老模型,证明益气活血药GSC可以延缓糖尿病小鼠颈总动脉、胸主动脉血管衰老,心脑老化及高糖诱导的HASMC衰老。并通过AMPK抑制剂和RNA干扰技术干扰HASMC AMPK表达后,观察GSC对HASMC衰老的作用,进一步证实GSC延缓糖尿病血管衰老及并发症的机制可能是通过调控AMPK/mTOR通路及其上下游通路来发挥作用的,以往未从此角度探索益气活血药对血管衰老及血管衰老并发症的保护作用,为中医药防治糖尿病心脑血管疾病提供了新思路。